Μέχρι σήμερα, εξακολουθούν να υπάρχουν ποικίλες ανθρώπινες ασθένειες με άγνωστη αιτιολογία. Για πολλές από αυτές τις ασθένειες έχει προταθεί ιική προέλευση, με έμφαση στη σημασία της συνεχούς αναζήτησης νέων ιών 1 , 2 , 3 .
Ωστόσο, αντιμετωπίζονται μείζονες δυσκολίες κατά την αναζήτηση νέων ιών. Κατ 'αρχάς, ορισμένοι ιοί δεν αναδιπλασιάζονται in vitro , τουλάχιστον όχι στα κύτταρα που χρησιμοποιούνται συνήθως σε ιογενή διαγνωστικά. Δεύτερον, για τους ιούς που αναδιπλασιάζονται in vitroκαι προκαλούν ένα κυτταροπαθητικό αποτέλεσμα (CPE), οι μετέπειτα μέθοδοι ταυτοποίησης του ιού μπορεί να αποτύχουν. Τα αντισώματα που δημιουργούνται έναντι γνωστών ιών μπορεί να μην αναγνωρίζουν τον καλλιεργημένο ιό και οι μέθοδοι PCR που είναι ειδικές για τον ιό δεν μπορούν να ενισχύσουν το νέο γονιδίωμα του ιού. Για την επίλυση και των δύο προβλημάτων, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο για την ανακάλυψη ιού με βάση την τεχνική πολυμορφισμού μήκους θραύσματος περιορισμένου cDNA (cDNA-AFLP 4 ). Εδώ αναφέρουμε την ταυτοποίηση ενός νέου κορωναϊού χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο του Virus-Discovery-cDNA-AFLP (VIDISCA).
Οι κοροναϊοί, ένα γένος της οικογένειας Coronaviridae , είναι επικαλυμμένοι ιοί με ένα μεγάλο γονιδίωμα RNA συν-κλώνου. Το γονιδιωματικό RNA έχει μέγεθος 27-32 kb, καλύπτεται και πολυαδενυλιώθηκε. Έχουν περιγραφεί τρεις ορολογικά διακριτές ομάδες κοροναϊών. Σε κάθε ομάδα, οι ιοί χαρακτηρίζονται από την περιοχή ξενιστή τους και την αλληλουχία του γονιδιώματος. Οι κοροναϊοί έχουν ταυτοποιηθεί σε ποντίκια, αρουραίους, κοτόπουλα, γαλοπούλες, χοίρους, σκύλους, γάτες, κουνέλια, άλογα, βοοειδή και ανθρώπους και μπορούν να προκαλέσουν ποικίλες σοβαρές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της γαστρεντερίτιδας και των ασθενειών της αναπνευστικής οδού 5 , 6 . Έχουν μελετηθεί λεπτομερώς τρεις ανθρώπινοι κοροναϊοί. HCoV-229E και HCoV-OC43 εντοπίστηκαν στα μέσα της δεκαετίας του 1960 και είναι γνωστό ότι προκαλούν το κοινό κρυολόγημα 7 , 8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Το πρόσφατα αναγνωρισμένο SARS-CoV προκαλεί μια απειλητική για τη ζωή πνευμονία και είναι ο πιο παθογόνος ανθρώπινος κοροναϊός που έχει εντοπιστεί μέχρι στιγμής 16 , 17 , 18 . Το SARS-CoV είναι πιθανό να κατοικεί σε μια δεξαμενή ζώων και πρόσφατα ξεκίνησε την επιδημία στους ανθρώπους μέσω της ζωονοτικής μετάδοσης 19 , 20 . Έχει προταθεί ότι το SARS-CoV είναι το πρώτο μέλος μιας τέταρτης ομάδας κοροναϊών, ή ότι είναι ένα απομακρυσμένο από την ομάδα 2 (αναφορές 21 , 22 ).
Ο νέος κοροναϊός που παρουσιάζουμε εδώ απομονώθηκε από ένα παιδί που πάσχει από βρογχιολίτιδα και επιπεφυκίτιδα. Αυτό δεν ήταν μια μεμονωμένη περίπτωση, καθώς εντοπίσαμε τον ιό σε κλινικά δείγματα από επτά επιπλέον άτομα, τόσο βρέφη όσο και ενήλικες, κατά την τελευταία χειμερινή περίοδο. Επιλύσαμε επίσης την πλήρη αλληλουχία του ιικού γονιδιώματος, η οποία αποκάλυψε αρκετά μοναδικά χαρακτηριστικά.
Οι κοροναϊοί, ένα γένος της οικογένειας Coronaviridae , είναι επικαλυμμένοι ιοί με ένα μεγάλο γονιδίωμα RNA συν-κλώνου. Το γονιδιωματικό RNA έχει μέγεθος 27-32 kb, καλύπτεται και πολυαδενυλιώθηκε. Έχουν περιγραφεί τρεις ορολογικά διακριτές ομάδες κοροναϊών. Σε κάθε ομάδα, οι ιοί χαρακτηρίζονται από την περιοχή ξενιστή τους και την αλληλουχία του γονιδιώματος. Οι κοροναϊοί έχουν ταυτοποιηθεί σε ποντίκια, αρουραίους, κοτόπουλα, γαλοπούλες, χοίρους, σκύλους, γάτες, κουνέλια, άλογα, βοοειδή και ανθρώπους και μπορούν να προκαλέσουν ποικίλες σοβαρές ασθένειες, συμπεριλαμβανομένης της γαστρεντερίτιδας και των ασθενειών της αναπνευστικής οδού 5 , 6 . Έχουν μελετηθεί λεπτομερώς τρεις ανθρώπινοι κοροναϊοί. HCoV-229E και HCoV-OC43 εντοπίστηκαν στα μέσα της δεκαετίας του 1960 και είναι γνωστό ότι προκαλούν το κοινό κρυολόγημα 7 , 8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . Το πρόσφατα αναγνωρισμένο SARS-CoV προκαλεί μια απειλητική για τη ζωή πνευμονία και είναι ο πιο παθογόνος ανθρώπινος κοροναϊός που έχει εντοπιστεί μέχρι στιγμής 16 , 17 , 18 . Το SARS-CoV είναι πιθανό να κατοικεί σε μια δεξαμενή ζώων και πρόσφατα ξεκίνησε την επιδημία στους ανθρώπους μέσω της ζωονοτικής μετάδοσης 19 , 20 . Έχει προταθεί ότι το SARS-CoV είναι το πρώτο μέλος μιας τέταρτης ομάδας κοροναϊών, ή ότι είναι ένα απομακρυσμένο από την ομάδα 2 (αναφορές 21 , 22 ).
Ο νέος κοροναϊός που παρουσιάζουμε εδώ απομονώθηκε από ένα παιδί που πάσχει από βρογχιολίτιδα και επιπεφυκίτιδα. Αυτό δεν ήταν μια μεμονωμένη περίπτωση, καθώς εντοπίσαμε τον ιό σε κλινικά δείγματα από επτά επιπλέον άτομα, τόσο βρέφη όσο και ενήλικες, κατά την τελευταία χειμερινή περίοδο. Επιλύσαμε επίσης την πλήρη αλληλουχία του ιικού γονιδιώματος, η οποία αποκάλυψε αρκετά μοναδικά χαρακτηριστικά.
Αποτελέσματα
Απομόνωση ιού από παιδί με οξεία αναπνευστική νόσο
Τον Ιανουάριο του 2003, ένα παιδί ηλικίας 7 μηνών εισήχθη στο νοσοκομείο με κορύζα, επιπεφυκίτιδα και πυρετό. Η ακτινογραφία θώρακα αποκάλυψε τυπικά χαρακτηριστικά της βρογχιολίτιδας. Ένα ρινοφαρυγγικό δείγμα αναρρόφησης συλλέχθηκε 5 ημέρες μετά την εμφάνιση της ασθένειας (δείγμα NL63). Οι διαγνωστικές εξετάσεις για τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό, τον αδενοϊό, τους ιούς της γρίπης Α και Β, τους τύπους 1, 2 και 3 του ιού της παραγρίπης, του ρινοϊού, του εντεροϊού, του HCoV-229E και του HCoV-OC43 έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα. Το κλινικό δείγμα στη συνέχεια ενοφθαλμίστηκε σε ινοβλάστες πνεύμονα ανθρώπινου εμβρύου, κύτταρα νεφρού τριτοταγούς πιθήκου ( Cynomolgusμαϊμού) και κύτταρα HeLa. Η CPE ανιχνεύθηκε αποκλειστικά σε νεφρικά κύτταρα τριτοταγούς πιθήκου και καταγράφηκε αρχικά 8 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό. Η CPE ήταν διάχυτη, με διαθλαστική εμφάνιση στα επηρεαζόμενα κύτταρα ακολουθούμενη από απόσπαση κυττάρων. Παρατηρήθηκε πιο έντονη CPE κατά τη μετάβαση στην κυτταρική γραμμή νεφρού πιθήκου LLC-MK2, με στρογγυλοποίηση γενικών κυττάρων και μέτρια μεγέθυνση κυττάρου ( Συμπληρωματική Εικόνα 1Σε σύνδεση). Πρόσθετες υποκαλλιέργειες σε ανθρώπινες πνευμονικές ινοβλάστες εμβρύου, κύτταρα ραβδομυοσάρκωμα και κύτταρα Vero παρέμειναν αρνητικές για CPE. Οι δοκιμασίες ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού, του αδενοϊού, των ιών της γρίπης Α και Β και των τύπων 1, 2 και 3 του ιού παραγρίπης παρέμειναν αρνητικοί. Οι δοκιμές ευαισθησίας σε οξύτητα και χλωροφόρμιο έδειξαν ότι ο ιός ήταν πιθανότατα περιτυλιγμένος και δεν ανήκε στην ομάδα πικορναϊού 23 .
Τον Ιανουάριο του 2003, ένα παιδί ηλικίας 7 μηνών εισήχθη στο νοσοκομείο με κορύζα, επιπεφυκίτιδα και πυρετό. Η ακτινογραφία θώρακα αποκάλυψε τυπικά χαρακτηριστικά της βρογχιολίτιδας. Ένα ρινοφαρυγγικό δείγμα αναρρόφησης συλλέχθηκε 5 ημέρες μετά την εμφάνιση της ασθένειας (δείγμα NL63). Οι διαγνωστικές εξετάσεις για τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό, τον αδενοϊό, τους ιούς της γρίπης Α και Β, τους τύπους 1, 2 και 3 του ιού της παραγρίπης, του ρινοϊού, του εντεροϊού, του HCoV-229E και του HCoV-OC43 έδωσαν αρνητικά αποτελέσματα. Το κλινικό δείγμα στη συνέχεια ενοφθαλμίστηκε σε ινοβλάστες πνεύμονα ανθρώπινου εμβρύου, κύτταρα νεφρού τριτοταγούς πιθήκου ( Cynomolgusμαϊμού) και κύτταρα HeLa. Η CPE ανιχνεύθηκε αποκλειστικά σε νεφρικά κύτταρα τριτοταγούς πιθήκου και καταγράφηκε αρχικά 8 ημέρες μετά τον ενοφθαλμισμό. Η CPE ήταν διάχυτη, με διαθλαστική εμφάνιση στα επηρεαζόμενα κύτταρα ακολουθούμενη από απόσπαση κυττάρων. Παρατηρήθηκε πιο έντονη CPE κατά τη μετάβαση στην κυτταρική γραμμή νεφρού πιθήκου LLC-MK2, με στρογγυλοποίηση γενικών κυττάρων και μέτρια μεγέθυνση κυττάρου ( Συμπληρωματική Εικόνα 1Σε σύνδεση). Πρόσθετες υποκαλλιέργειες σε ανθρώπινες πνευμονικές ινοβλάστες εμβρύου, κύτταρα ραβδομυοσάρκωμα και κύτταρα Vero παρέμειναν αρνητικές για CPE. Οι δοκιμασίες ανοσοφθορισμού για την ανίχνευση του αναπνευστικού συγκυτιακού ιού, του αδενοϊού, των ιών της γρίπης Α και Β και των τύπων 1, 2 και 3 του ιού παραγρίπης παρέμειναν αρνητικοί. Οι δοκιμές ευαισθησίας σε οξύτητα και χλωροφόρμιο έδειξαν ότι ο ιός ήταν πιθανότατα περιτυλιγμένος και δεν ανήκε στην ομάδα πικορναϊού 23 .
Ανίχνευση ιών με τη μέθοδο VIDISCA
Η ταυτοποίηση άγνωστων παθογόνων με τη χρήση εργαλείων μοριακής βιολογίας είναι δύσκολη επειδή η αλληλουχία στόχος δεν είναι γνωστή, επομένως δεν μπορούν να σχεδιαστούν ειδικοί γονιδιωματικοί εκκινητές PCR. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, αναπτύξαμε τη μέθοδο VIDISCA με βάση την τεχνική cDNA-AFLP 4 . Το πλεονέκτημα του VIDISCA είναι ότι δεν απαιτείται προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας, καθώς η παρουσία περιοχών ενζύμου περιορισμού είναι επαρκής για την εξασφάλιση ενίσχυσης PCR. Το δείγμα εισόδου μπορεί να είναι είτε πλάσμα αίματος ή ορός, είτε υπερκείμενο καλλιέργειας. Ενώ το cDNA-AFLP ξεκινά με απομονωμένο mRNA, το VIDISCA αρχίζει με μία επεξεργασία για να εμπλουτίσει επιλεκτικά το ιικό νουκλεϊκό οξύ, συμπεριλαμβανομένου ενός σταδίου φυγοκεντρίσεως για να απομακρυνθούν τα υπολειμματικά κύτταρα και τα μιτοχόνδρια ( Σχήμα 1α). Μια θεραπεία με ϋΝάση χρησιμοποιείται επίσης για την απομάκρυνση παρεμβαλλόμενου χρωμοσωμικού και μιτοχονδριακού ϋΝΑ από αποικοδομημένα κύτταρα (το νουκλεϊκό οξύ του ιού είναι προστατευμένο εντός του ιικού σωματιδίου). Τέλος, επιλέγοντας συχνά περιοριστικά ένζυμα περιορισμού, η μέθοδος μπορεί να ρυθμιστεί με τέτοιο τρόπο ώστε οι περισσότεροι ιοί να ενισχυθούν. Ήμασταν σε θέση να ενισχύσουμε τα ιογενή νουκλεϊνικά οξέα σε επεξεργασμένο με EDTA πλάσμα από άτομο με ιική μόλυνση από ηπατίτιδα Β, και από άτομο με οξεία λοίμωξη από B16 μόσχευμα ( Εικόνα 1b ). Η τεχνική μπορεί επίσης να ανιχνεύσει HIV-1 σε κυτταροκαλλιέργεια, αποδεικνύοντας την ικανότητά του να ταυτοποιεί τόσο ιούς RNA όσο και ϋΝΑ ( Σχήμα 1b ).
Η μέθοδος VIDISCA.
( α ) Σχηματική επισκόπηση των βημάτων στη μέθοδο VIDISCA. ( β ) Παραδείγματα αναγνώρισης του ιού με τη μεσολάβηση VIDISCA. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου (παρβοϊού Β19) ή μετασχηματισμού αγαρόζης (ΗΒν και ΗΓν-1). Lane M, δείκτες μοριακού βάρους DNA. -, αρνητικοί έλεγχοι. +, Προϊόντα VIDISCA PCR για HBV (ενισχύθηκε με εκκινητές Hin P1i-T / MSE Ι-Τ), παρβοϊό Β19 ( Hin P1i πρότυπο εκκινητή μόνο) ή HIV-1 ( Eco RI-A / MSE I-C εκκινητές). ( γ ) προϊόντα VIDISCA PCR για HCoV-NL63. Hin P1I-G και MseΙΑ εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για εκλεκτική ενίσχυση. τα προϊόντα απεικονίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης Metaphor. Οι διαδρομές 1 και 2, διπλό προϊόν PCR του καλλιεργημένου HCoV-NL63 που συλλέχθηκε από κύτταρα LLC-MK2. 3 και 4, διπλό υπερκείμενο ελέγχου από μη μολυσμένα κύτταρα LLC-MK2. 5 και 6, αντίγραφα αρνητικών μαρτύρων που περιέχουν νερό. Μ, 25-bp δείκτη μοριακού βάρους. Το βέλος υποδεικνύει θραύσμα HCoV-NL63 που αποκόπηκε από πήκτωμα και προσδιορίστηκε η αλληλουχία του.
Το υπερκείμενο της CPE-θετικής LLC-MK2 καλλιέργειας NL63 αναλύθηκε με VIDISCA. Το υπερκείμενο των μη μολυσμένων κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά το δεύτερο στάδιο ενίσχυσης PCR, στο δείγμα δοκιμής υπήρχαν μοναδικά και προεξέχοντα θραύσματα DNA αλλά όχι στον έλεγχο (1 από τις 16 επιλεκτικές αντιδράσεις PCR παρουσιάζεται στο σχήμα 1γ ). Αυτά τα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν και προσδιορίσθηκε η αλληλουχία τους. Τα δεκατρία από τα 16 θραύσματα έδειξαν ομοιότητα αλληλουχίας με τα μέλη της οικογένειας των κοροναϊών, αλλά σημαντική απόκλιση αλληλουχίας με γνωστούς κοροναϊούς ήταν εμφανής σε όλα τα θραύσματα, υποδεικνύοντας ότι είχαμε εντοπίσει έναν νέο κορωναϊό. Οι αλληλουχίες των 13 θραυσμάτων VIDISCA παρέχονται στο συμπληρωματικό σχήμα 2 online.
Η ταυτοποίηση άγνωστων παθογόνων με τη χρήση εργαλείων μοριακής βιολογίας είναι δύσκολη επειδή η αλληλουχία στόχος δεν είναι γνωστή, επομένως δεν μπορούν να σχεδιαστούν ειδικοί γονιδιωματικοί εκκινητές PCR. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, αναπτύξαμε τη μέθοδο VIDISCA με βάση την τεχνική cDNA-AFLP 4 . Το πλεονέκτημα του VIDISCA είναι ότι δεν απαιτείται προηγούμενη γνώση της αλληλουχίας, καθώς η παρουσία περιοχών ενζύμου περιορισμού είναι επαρκής για την εξασφάλιση ενίσχυσης PCR. Το δείγμα εισόδου μπορεί να είναι είτε πλάσμα αίματος ή ορός, είτε υπερκείμενο καλλιέργειας. Ενώ το cDNA-AFLP ξεκινά με απομονωμένο mRNA, το VIDISCA αρχίζει με μία επεξεργασία για να εμπλουτίσει επιλεκτικά το ιικό νουκλεϊκό οξύ, συμπεριλαμβανομένου ενός σταδίου φυγοκεντρίσεως για να απομακρυνθούν τα υπολειμματικά κύτταρα και τα μιτοχόνδρια ( Σχήμα 1α). Μια θεραπεία με ϋΝάση χρησιμοποιείται επίσης για την απομάκρυνση παρεμβαλλόμενου χρωμοσωμικού και μιτοχονδριακού ϋΝΑ από αποικοδομημένα κύτταρα (το νουκλεϊκό οξύ του ιού είναι προστατευμένο εντός του ιικού σωματιδίου). Τέλος, επιλέγοντας συχνά περιοριστικά ένζυμα περιορισμού, η μέθοδος μπορεί να ρυθμιστεί με τέτοιο τρόπο ώστε οι περισσότεροι ιοί να ενισχυθούν. Ήμασταν σε θέση να ενισχύσουμε τα ιογενή νουκλεϊνικά οξέα σε επεξεργασμένο με EDTA πλάσμα από άτομο με ιική μόλυνση από ηπατίτιδα Β, και από άτομο με οξεία λοίμωξη από B16 μόσχευμα ( Εικόνα 1b ). Η τεχνική μπορεί επίσης να ανιχνεύσει HIV-1 σε κυτταροκαλλιέργεια, αποδεικνύοντας την ικανότητά του να ταυτοποιεί τόσο ιούς RNA όσο και ϋΝΑ ( Σχήμα 1b ).
Η μέθοδος VIDISCA.
( α ) Σχηματική επισκόπηση των βημάτων στη μέθοδο VIDISCA. ( β ) Παραδείγματα αναγνώρισης του ιού με τη μεσολάβηση VIDISCA. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής με χρώση βρωμιούχου αιθιδίου (παρβοϊού Β19) ή μετασχηματισμού αγαρόζης (ΗΒν και ΗΓν-1). Lane M, δείκτες μοριακού βάρους DNA. -, αρνητικοί έλεγχοι. +, Προϊόντα VIDISCA PCR για HBV (ενισχύθηκε με εκκινητές Hin P1i-T / MSE Ι-Τ), παρβοϊό Β19 ( Hin P1i πρότυπο εκκινητή μόνο) ή HIV-1 ( Eco RI-A / MSE I-C εκκινητές). ( γ ) προϊόντα VIDISCA PCR για HCoV-NL63. Hin P1I-G και MseΙΑ εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν για εκλεκτική ενίσχυση. τα προϊόντα απεικονίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης Metaphor. Οι διαδρομές 1 και 2, διπλό προϊόν PCR του καλλιεργημένου HCoV-NL63 που συλλέχθηκε από κύτταρα LLC-MK2. 3 και 4, διπλό υπερκείμενο ελέγχου από μη μολυσμένα κύτταρα LLC-MK2. 5 και 6, αντίγραφα αρνητικών μαρτύρων που περιέχουν νερό. Μ, 25-bp δείκτη μοριακού βάρους. Το βέλος υποδεικνύει θραύσμα HCoV-NL63 που αποκόπηκε από πήκτωμα και προσδιορίστηκε η αλληλουχία του.
Το υπερκείμενο της CPE-θετικής LLC-MK2 καλλιέργειας NL63 αναλύθηκε με VIDISCA. Το υπερκείμενο των μη μολυσμένων κυττάρων χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Μετά το δεύτερο στάδιο ενίσχυσης PCR, στο δείγμα δοκιμής υπήρχαν μοναδικά και προεξέχοντα θραύσματα DNA αλλά όχι στον έλεγχο (1 από τις 16 επιλεκτικές αντιδράσεις PCR παρουσιάζεται στο σχήμα 1γ ). Αυτά τα θραύσματα κλωνοποιήθηκαν και προσδιορίσθηκε η αλληλουχία τους. Τα δεκατρία από τα 16 θραύσματα έδειξαν ομοιότητα αλληλουχίας με τα μέλη της οικογένειας των κοροναϊών, αλλά σημαντική απόκλιση αλληλουχίας με γνωστούς κοροναϊούς ήταν εμφανής σε όλα τα θραύσματα, υποδεικνύοντας ότι είχαμε εντοπίσει έναν νέο κορωναϊό. Οι αλληλουχίες των 13 θραυσμάτων VIDISCA παρέχονται στο συμπληρωματικό σχήμα 2 online.
Ανίχνευση HCoV-NL63 σε δείγματα ασθενών
Για να δείξουμε ότι το HCoV-NL63 προέρχεται από το ρινοφαρυγγικό αναρρόφησης του παιδιού, σχεδιάσαμε μια διαγνωστική RT-PCR που ανιχνεύει ειδικά το HCoV-NL63. Αυτή η δοκιμή επιβεβαίωσε την παρουσία HCoV-NL63 στο κλινικό δείγμα. Η αλληλουχία του προϊόντος RT-PCR του γονιδίου lb ήταν ταυτόσημη με εκείνη του ιού που αναγνωρίστηκε κατά την in vitro μετάπτωση σε LLC-ΜΚ2 κύτταρα (δεδομένα δεν δείχνονται).
Έχοντας επιβεβαιώσει ότι ο καλλιεργημένος κοροναϊός προήλθε από το παιδί, παραμένει το ερώτημα εάν αυτό ήταν μια απομονωμένη κλινική περίπτωση ή αν το HCoV-NL63 κυκλοφορεί στον άνθρωπο. Για να αντιμετωπιστεί αυτή η ερώτηση, χρησιμοποιήσαμε δύο διαγνωστικές εξετάσεις RT-PCR για την εξέταση αναπνευστικών δειγμάτων νοσηλευόμενων ατόμων και επισκεπτών στην εξωτερική κλινική μεταξύ Δεκεμβρίου 2002 και Αυγούστου 2003 ( Εικόνα 2 ). Εντοπίσαμε επτά επιπλέον άτομα που μεταφέρουν HCoV-NL63 ( Πίνακας 1 ). Η ανάλυση αλληλουχίας των προϊόντων PCR έδειξε την ύπαρξη μερικών χαρακτηριστικών σημειακών μεταλλάξεων σε πολλά δείγματα, υποδηλώνοντας ότι αρκετοί ιοί με διαφορετικούς μοριακούς δείκτες μπορούν να συσσωρευτούν ( Σχήμα 3 και Συμπληρωματικό Σχήμα 3Σε σύνδεση). Τουλάχιστον πέντε από τα HCoV-NL63 θετικά άτομα υπέφεραν από ασθένεια της αναπνευστικής οδού. τα κλινικά δεδομένα δύο ατόμων δεν ήταν διαθέσιμα. Συμπεριλαμβανομένης της περίπτωσης δείκτη, πέντε από τους ασθενείς ήταν παιδιά ηλικίας κάτω του 1 έτους και τρεις ασθενείς ήταν ενήλικες. Δύο ενήλικες ήταν πιθανό να είναι ανοσοκατασταλμένοι, καθώς ένας από αυτούς ήταν δέκτης μοσχεύματος μυελού των οστών και ο άλλος ένας θετικός στον HIV ασθενής πάσχει από AIDS, με πολύ χαμηλό αριθμό κυττάρων CD4 + ( Πίνακας 1 ). Δεν υπήρχαν διαθέσιμα κλινικά δεδομένα για τον τρίτο ενήλικα. Ένας ασθενής ήταν ταυτόχρονα μολυσμένος με τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (αρ. 72) και ο ασθενής με HIV (αριθμός 466) έφερε Pneumocystis carinii. Κανένας άλλος αναπνευστικός παράγοντας δεν βρέθηκε στους άλλους ασθενείς, υποδηλώνοντας ότι τα αναπνευστικά συμπτώματα προκλήθηκαν από HCoV-NL63. Όλα τα θετικά δείγματα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της τελευταίας χειμερινή περίοδο, με μια συχνότητα ανίχνευσης του 7% τον Ιανουάριο του 2003. Κανένα από τα 306 δείγματα που συλλέγονται την άνοιξη και το θέρος του 2003 περιείχε HCoV-NL63 ( Ρ <0.01 με το διπλής ουράς t test) .
Ανίχνευση του HCoV-NL63 στους χειμερινούς μήνες του 2002 και του 2003.
( Α ) Αριθμός ασθενών που υποβάλλεται σε έλεγχο ανά μήνα. ( β ) Ποσοστό θετικών ασθενών για HCoV-NL63.
Για να δείξουμε ότι το HCoV-NL63 προέρχεται από το ρινοφαρυγγικό αναρρόφησης του παιδιού, σχεδιάσαμε μια διαγνωστική RT-PCR που ανιχνεύει ειδικά το HCoV-NL63. Αυτή η δοκιμή επιβεβαίωσε την παρουσία HCoV-NL63 στο κλινικό δείγμα. Η αλληλουχία του προϊόντος RT-PCR του γονιδίου lb ήταν ταυτόσημη με εκείνη του ιού που αναγνωρίστηκε κατά την in vitro μετάπτωση σε LLC-ΜΚ2 κύτταρα (δεδομένα δεν δείχνονται).
Έχοντας επιβεβαιώσει ότι ο καλλιεργημένος κοροναϊός προήλθε από το παιδί, παραμένει το ερώτημα εάν αυτό ήταν μια απομονωμένη κλινική περίπτωση ή αν το HCoV-NL63 κυκλοφορεί στον άνθρωπο. Για να αντιμετωπιστεί αυτή η ερώτηση, χρησιμοποιήσαμε δύο διαγνωστικές εξετάσεις RT-PCR για την εξέταση αναπνευστικών δειγμάτων νοσηλευόμενων ατόμων και επισκεπτών στην εξωτερική κλινική μεταξύ Δεκεμβρίου 2002 και Αυγούστου 2003 ( Εικόνα 2 ). Εντοπίσαμε επτά επιπλέον άτομα που μεταφέρουν HCoV-NL63 ( Πίνακας 1 ). Η ανάλυση αλληλουχίας των προϊόντων PCR έδειξε την ύπαρξη μερικών χαρακτηριστικών σημειακών μεταλλάξεων σε πολλά δείγματα, υποδηλώνοντας ότι αρκετοί ιοί με διαφορετικούς μοριακούς δείκτες μπορούν να συσσωρευτούν ( Σχήμα 3 και Συμπληρωματικό Σχήμα 3Σε σύνδεση). Τουλάχιστον πέντε από τα HCoV-NL63 θετικά άτομα υπέφεραν από ασθένεια της αναπνευστικής οδού. τα κλινικά δεδομένα δύο ατόμων δεν ήταν διαθέσιμα. Συμπεριλαμβανομένης της περίπτωσης δείκτη, πέντε από τους ασθενείς ήταν παιδιά ηλικίας κάτω του 1 έτους και τρεις ασθενείς ήταν ενήλικες. Δύο ενήλικες ήταν πιθανό να είναι ανοσοκατασταλμένοι, καθώς ένας από αυτούς ήταν δέκτης μοσχεύματος μυελού των οστών και ο άλλος ένας θετικός στον HIV ασθενής πάσχει από AIDS, με πολύ χαμηλό αριθμό κυττάρων CD4 + ( Πίνακας 1 ). Δεν υπήρχαν διαθέσιμα κλινικά δεδομένα για τον τρίτο ενήλικα. Ένας ασθενής ήταν ταυτόχρονα μολυσμένος με τον αναπνευστικό συγκυτιακό ιό (αρ. 72) και ο ασθενής με HIV (αριθμός 466) έφερε Pneumocystis carinii. Κανένας άλλος αναπνευστικός παράγοντας δεν βρέθηκε στους άλλους ασθενείς, υποδηλώνοντας ότι τα αναπνευστικά συμπτώματα προκλήθηκαν από HCoV-NL63. Όλα τα θετικά δείγματα συλλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της τελευταίας χειμερινή περίοδο, με μια συχνότητα ανίχνευσης του 7% τον Ιανουάριο του 2003. Κανένα από τα 306 δείγματα που συλλέγονται την άνοιξη και το θέρος του 2003 περιείχε HCoV-NL63 ( Ρ <0.01 με το διπλής ουράς t test) .
Ανίχνευση του HCoV-NL63 στους χειμερινούς μήνες του 2002 και του 2003.
( Α ) Αριθμός ασθενών που υποβάλλεται σε έλεγχο ανά μήνα. ( β ) Ποσοστό θετικών ασθενών για HCoV-NL63.
Τραπέζι 1
Θετικοί ασθενείς για HCoV-NL63
Φυλογενετική ανάλυση αλληλουχιών RT-PCR του γονιδίου Ια από HCoV-NL63 θετικούς ασθενείς.
HCoV-229E χρησιμοποιήθηκε για να ριζώσει το δέντρο.
Θετικοί ασθενείς για HCoV-NL63
Φυλογενετική ανάλυση αλληλουχιών RT-PCR του γονιδίου Ια από HCoV-NL63 θετικούς ασθενείς.
HCoV-229E χρησιμοποιήθηκε για να ριζώσει το δέντρο.
Πλήρης ανάλυση γονιδιώματος του HCoV-NL63
Τα γονιδιώματα των κοροναϊών έχουν μια χαρακτηριστική οργάνωση. Τα 5 'δύο τρίτα περιέχουν τα γονίδια 1a και 1b που κωδικοποιούν τις μη δομικές πολυπρωτεΐνες, ακολουθούμενες από τα γονίδια που κωδικοποιούν τέσσερις δομικές πρωτεΐνες: ακίδα (S), περίβλημα (E), μεμβράνη (M) και νουκλεοκαψίδιο (N). Τα γονιδιώματα γνωστών κοροναϊών περιέχουν έναν μεταβλητό αριθμό μοναδικών χαρακτηριστικών ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης (ORF) που κωδικοποιούν μη δομικές πρωτεΐνες είτε μεταξύ των γονιδίων 1b και S, μεταξύ των γονιδίων S και Ε, μεταξύ των γονιδίων Μ και Ν, ή κατάντη του γονιδίου Ν.
Για να καθοριστεί αν η οργάνωση γονιδιώματος HCoV-NL63 μοιράζεται αυτά τα χαρακτηριστικά, κατασκευάσαμε μια συλλογή cDNA με καθαρό απόθεμα ιού ως υλικό εισόδου. Συνολικά 475 θραύσματα γονιδιώματος αναλύθηκαν, με μια μέση κάλυψη επτά αλληλουχιών ανά νουκλεοτίδιο. Ειδικές αντιδράσεις PCR σχεδιάστηκαν για να γεμίσουν κενά και για περιοχές αλληλουχίας με δεδομένα ακολουθίας χαμηλής ποιότητας. Συνδυάσαμε αυτό με 5 'και 3' ταχεία ενίσχυση των cDNA άκρων για να λύσουμε την πλήρη ακολουθία γονιδιώματος HCoV-NL63.
Το γονιδίωμα RNA του HCoV-NL63 αποτελείται από 27.553 νουκλεοτίδια και πολυ-Α ουρά. Με περιεκτικότητα GC 34%, το HCoV-NL63 έχει τη χαμηλότερη περιεκτικότητα GC μεταξύ των Coronaviridae , οι οποίες κυμαίνονται από 37-42% (αναφ. 24 ). Το λογισμικό ZCurve χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των ORFs 25 και η διαμόρφωση του γονιδιώματος απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας την ομοιότητα με τους γνωστούς κοροναϊούς ως οδηγό ( Σχήμα 4α και Συμπληρωματικός Πίνακας 1Σε σύνδεση). Μικρές μη μεταφραζόμενες περιοχές (UTRs) 286 και 287 νουκλεοτιδίων υπάρχουν στα άκρα 5 'και 3', αντίστοιχα. Τα γονίδια Ια και 1b κωδικοποιούν την RNA πολυμεράση και τις πρωτεάσες που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του ιού. Μία πιθανή δομή ψευδοκώτου είναι παρούσα στη θέση 12,439 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), τα οποία μπορεί να παρέχουν το σήμα -1 μετατόπισης πλαισίου για μετάφραση της 1b πολυπρωτεΐνης. Τα γονίδια που προβλέπεται ότι κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες S, Ε, Μ και Ν βρίσκονται στο 3 'τμήμα του γονιδιώματος. Το γονίδιο αιμαγλουτινίνης-εστεράσης, το οποίο υπάρχει σε μερικούς κοροναϊούς της ομάδας 2, δεν υπάρχει στο HCoV-NL63. Το ORF3, που εντοπίζεται μεταξύ των γονιδίων S και Ε, πιθανώς κωδικοποιεί μία μόνο βοηθητική μη δομική πρωτεΐνη. αυτό το γονίδιο έδειξε μόνο περιορισμένη ομοιότητα προς ORF4A και ORF4B του HCoV-229E και ORF3 ιού επιδημικής διάρροιας χοίρου (PEDV).
HCoV-NL63 οργάνωση γονιδιώματος και φυλογενετική ανάλυση.
( α ) Τα ORF που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες 1a, 1b, S, ORF3, Ε, Μ και Ν πλευρίζουν με 286-νουκλεοτίδιο 5 'UTR και 287-νουκλεοτίδιο 3' UTR. Οι συντεταγμένες κάθε ORF παρέχονται στον συμπληρωματικό πίνακα 1 online. ( β ) Φυλογενετική ανάλυση του HCoV-NL63, χρησιμοποιώντας νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που προέβλεπαν ότι κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες 1a, 1b, S, M και Ν (βλ. συμπληρωματικές μεθόδους online για τους αριθμούς πρόσβασης της GenBank). Κόκκινοι ιοί ομάδας 1. μπλε, ομάδα 2? πράσινο, ομάδα 3? μοβ, SARS-CoV. MHV, ιός ηπατίτιδας ποντικού · IBV, ιός μολυσματικής βρογχίτιδας των πτηνών, BCoV, κοροναϊό βοοειδούς. FCoV, εντερικός κοροναϊός αιλουροειδών · CCoV, κορνοϊό του σκύλου. FIPV, ιός μολυσματικής περιτονίτιδας από αιλουροειδή · EqCoV, ιό κορώνα ιού · TCoV, κοροναϊό γαλοπούλας.
Οι πολυπρωτεϊνες 1α και 1ab μεταφράζονται από το γονιδιωματικό RNA, αλλά οι υπόλοιπες ιικές πρωτεΐνες μεταφράζονται από υπογονιδιωματικά mRNAs που παράγονται με ασυνεχή μεταγραφή κατά τη διάρκεια της σύνθεσης αρνητικών κλώνων 26 . Κάθε υπογονιδιωματικό mRNA έχει ένα κοινό 5 'άκρο, που προέρχεται από το 5' τμήμα του γονιδιώματος (5 'οδηγός αλληλουχία), και κοινά τμήματα 3' διατερμίου. Ασυνεχής μεταγραφής απαιτεί ζεύξεως βάσεων μεταξύ cis -δράσης ρυθμιστικές αλληλουχίες μεταγραφής (TRSs), ένα που βρίσκεται κοντά »τμήμα του ιικού γονιδιώματος 5 (οι TRS leader) και άλλοι που βρίσκονται ανάντη κάθε των αντίστοιχων ORFs (σώμα TRSs) 27. Η τράπεζα cDNA που προσδιορίσαμε την αλληλουχία μας περιείχε αντίγραφα του υπογονιδιωματικού mRNA για την πρωτεΐνη Ν, παρέχοντας έτσι την ευκαιρία να χαρτογραφηθεί με ακρίβεια η αλληλουχία-οδηγός που είναι συντηγμένη με όλα τα υπογονιδιωματικά mRNAs. Ένας οδηγός 72 νουκλεοτιδίων αναγνωρίστηκε στο 5 'UTR. Έντεκα από δώδεκα νουκλεοτίδια του οδηγού TRS (5'-UCUCAACUAAAC-3 ') έδειξαν ομοιότητα με το σώμα TRS ανάντη του γονιδίου Ν. Υποτιθέμενα TRSs ταυτοποιήθηκαν επίσης πριν από τα γονίδια S, ORF3, Ε και Μ ( συμπληρωματικός πίνακας 2 online).
Στη συνέχεια ευθυγραμμίσαμε την αλληλουχία του HCoV-NL63 με τα πλήρη γονιδιώματα άλλων κοροναϊών. Η ποσοστιαία ταυτότητα νουκλεοτιδίων προσδιορίστηκε για κάθε γονίδιο και παρατίθεται στον Πίνακα 2 . Όλα τα γονίδια εκτός από το γονίδιο Μ είχαν την υψηλότερη ταυτότητα με HCoV-229E. Για να επιβεβαιωθεί ότι το HCoV-NL63 είναι ένα νέο μέλος των κορωναϊών της ομάδας 1, διεξήγαμε φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας την αλληλουχία νουκλεοτιδίων των γονιδίων 1a, 1b, S, M και Ν ( Εικόνα 4b). Για κάθε γονίδιο που αναλύθηκε, το HCoV-NL63 συσσωματώθηκε με τους κορωναϊούς της ομάδας 1. Τα γονίδια 1a, 1b και S του HCoV-NL63 σχετίζονται περισσότερο με αυτά των HCoV-229E. Ωστόσο, περαιτέρω επιθεώρηση αποκάλυψε έναν υποκλάδο των HCoV-NL63, HCoV-229E και PEDV. Φυλογενετική ανάλυση δεν μπορούσε να πραγματοποιηθεί για τα γονίδια ORF3 και Ε επειδή οι περιοχές ήταν πολύ μεταβλητές ή πολύ μικρές για ανάλυση, αντίστοιχα. Η ανάλυση Bootscan από την έκδοση λογισμικού Simplot 2.5 (αναφ. 28 ) δεν εντόπισε σημάδια ανασυνδυασμού (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).
Τα γονιδιώματα των κοροναϊών έχουν μια χαρακτηριστική οργάνωση. Τα 5 'δύο τρίτα περιέχουν τα γονίδια 1a και 1b που κωδικοποιούν τις μη δομικές πολυπρωτεΐνες, ακολουθούμενες από τα γονίδια που κωδικοποιούν τέσσερις δομικές πρωτεΐνες: ακίδα (S), περίβλημα (E), μεμβράνη (M) και νουκλεοκαψίδιο (N). Τα γονιδιώματα γνωστών κοροναϊών περιέχουν έναν μεταβλητό αριθμό μοναδικών χαρακτηριστικών ανοικτών πλαισίων ανάγνωσης (ORF) που κωδικοποιούν μη δομικές πρωτεΐνες είτε μεταξύ των γονιδίων 1b και S, μεταξύ των γονιδίων S και Ε, μεταξύ των γονιδίων Μ και Ν, ή κατάντη του γονιδίου Ν.
Για να καθοριστεί αν η οργάνωση γονιδιώματος HCoV-NL63 μοιράζεται αυτά τα χαρακτηριστικά, κατασκευάσαμε μια συλλογή cDNA με καθαρό απόθεμα ιού ως υλικό εισόδου. Συνολικά 475 θραύσματα γονιδιώματος αναλύθηκαν, με μια μέση κάλυψη επτά αλληλουχιών ανά νουκλεοτίδιο. Ειδικές αντιδράσεις PCR σχεδιάστηκαν για να γεμίσουν κενά και για περιοχές αλληλουχίας με δεδομένα ακολουθίας χαμηλής ποιότητας. Συνδυάσαμε αυτό με 5 'και 3' ταχεία ενίσχυση των cDNA άκρων για να λύσουμε την πλήρη ακολουθία γονιδιώματος HCoV-NL63.
Το γονιδίωμα RNA του HCoV-NL63 αποτελείται από 27.553 νουκλεοτίδια και πολυ-Α ουρά. Με περιεκτικότητα GC 34%, το HCoV-NL63 έχει τη χαμηλότερη περιεκτικότητα GC μεταξύ των Coronaviridae , οι οποίες κυμαίνονται από 37-42% (αναφ. 24 ). Το λογισμικό ZCurve χρησιμοποιήθηκε για την ταυτοποίηση των ORFs 25 και η διαμόρφωση του γονιδιώματος απεικονίστηκε χρησιμοποιώντας την ομοιότητα με τους γνωστούς κοροναϊούς ως οδηγό ( Σχήμα 4α και Συμπληρωματικός Πίνακας 1Σε σύνδεση). Μικρές μη μεταφραζόμενες περιοχές (UTRs) 286 και 287 νουκλεοτιδίων υπάρχουν στα άκρα 5 'και 3', αντίστοιχα. Τα γονίδια Ια και 1b κωδικοποιούν την RNA πολυμεράση και τις πρωτεάσες που είναι απαραίτητες για την αντιγραφή του ιού. Μία πιθανή δομή ψευδοκώτου είναι παρούσα στη θέση 12,439 (δεδομένα δεν παρουσιάζονται), τα οποία μπορεί να παρέχουν το σήμα -1 μετατόπισης πλαισίου για μετάφραση της 1b πολυπρωτεΐνης. Τα γονίδια που προβλέπεται ότι κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες S, Ε, Μ και Ν βρίσκονται στο 3 'τμήμα του γονιδιώματος. Το γονίδιο αιμαγλουτινίνης-εστεράσης, το οποίο υπάρχει σε μερικούς κοροναϊούς της ομάδας 2, δεν υπάρχει στο HCoV-NL63. Το ORF3, που εντοπίζεται μεταξύ των γονιδίων S και Ε, πιθανώς κωδικοποιεί μία μόνο βοηθητική μη δομική πρωτεΐνη. αυτό το γονίδιο έδειξε μόνο περιορισμένη ομοιότητα προς ORF4A και ORF4B του HCoV-229E και ORF3 ιού επιδημικής διάρροιας χοίρου (PEDV).
HCoV-NL63 οργάνωση γονιδιώματος και φυλογενετική ανάλυση.
( α ) Τα ORF που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες 1a, 1b, S, ORF3, Ε, Μ και Ν πλευρίζουν με 286-νουκλεοτίδιο 5 'UTR και 287-νουκλεοτίδιο 3' UTR. Οι συντεταγμένες κάθε ORF παρέχονται στον συμπληρωματικό πίνακα 1 online. ( β ) Φυλογενετική ανάλυση του HCoV-NL63, χρησιμοποιώντας νουκλεοτιδικές αλληλουχίες που προέβλεπαν ότι κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες 1a, 1b, S, M και Ν (βλ. συμπληρωματικές μεθόδους online για τους αριθμούς πρόσβασης της GenBank). Κόκκινοι ιοί ομάδας 1. μπλε, ομάδα 2? πράσινο, ομάδα 3? μοβ, SARS-CoV. MHV, ιός ηπατίτιδας ποντικού · IBV, ιός μολυσματικής βρογχίτιδας των πτηνών, BCoV, κοροναϊό βοοειδούς. FCoV, εντερικός κοροναϊός αιλουροειδών · CCoV, κορνοϊό του σκύλου. FIPV, ιός μολυσματικής περιτονίτιδας από αιλουροειδή · EqCoV, ιό κορώνα ιού · TCoV, κοροναϊό γαλοπούλας.
Οι πολυπρωτεϊνες 1α και 1ab μεταφράζονται από το γονιδιωματικό RNA, αλλά οι υπόλοιπες ιικές πρωτεΐνες μεταφράζονται από υπογονιδιωματικά mRNAs που παράγονται με ασυνεχή μεταγραφή κατά τη διάρκεια της σύνθεσης αρνητικών κλώνων 26 . Κάθε υπογονιδιωματικό mRNA έχει ένα κοινό 5 'άκρο, που προέρχεται από το 5' τμήμα του γονιδιώματος (5 'οδηγός αλληλουχία), και κοινά τμήματα 3' διατερμίου. Ασυνεχής μεταγραφής απαιτεί ζεύξεως βάσεων μεταξύ cis -δράσης ρυθμιστικές αλληλουχίες μεταγραφής (TRSs), ένα που βρίσκεται κοντά »τμήμα του ιικού γονιδιώματος 5 (οι TRS leader) και άλλοι που βρίσκονται ανάντη κάθε των αντίστοιχων ORFs (σώμα TRSs) 27. Η τράπεζα cDNA που προσδιορίσαμε την αλληλουχία μας περιείχε αντίγραφα του υπογονιδιωματικού mRNA για την πρωτεΐνη Ν, παρέχοντας έτσι την ευκαιρία να χαρτογραφηθεί με ακρίβεια η αλληλουχία-οδηγός που είναι συντηγμένη με όλα τα υπογονιδιωματικά mRNAs. Ένας οδηγός 72 νουκλεοτιδίων αναγνωρίστηκε στο 5 'UTR. Έντεκα από δώδεκα νουκλεοτίδια του οδηγού TRS (5'-UCUCAACUAAAC-3 ') έδειξαν ομοιότητα με το σώμα TRS ανάντη του γονιδίου Ν. Υποτιθέμενα TRSs ταυτοποιήθηκαν επίσης πριν από τα γονίδια S, ORF3, Ε και Μ ( συμπληρωματικός πίνακας 2 online).
Στη συνέχεια ευθυγραμμίσαμε την αλληλουχία του HCoV-NL63 με τα πλήρη γονιδιώματα άλλων κοροναϊών. Η ποσοστιαία ταυτότητα νουκλεοτιδίων προσδιορίστηκε για κάθε γονίδιο και παρατίθεται στον Πίνακα 2 . Όλα τα γονίδια εκτός από το γονίδιο Μ είχαν την υψηλότερη ταυτότητα με HCoV-229E. Για να επιβεβαιωθεί ότι το HCoV-NL63 είναι ένα νέο μέλος των κορωναϊών της ομάδας 1, διεξήγαμε φυλογενετική ανάλυση χρησιμοποιώντας την αλληλουχία νουκλεοτιδίων των γονιδίων 1a, 1b, S, M και Ν ( Εικόνα 4b). Για κάθε γονίδιο που αναλύθηκε, το HCoV-NL63 συσσωματώθηκε με τους κορωναϊούς της ομάδας 1. Τα γονίδια 1a, 1b και S του HCoV-NL63 σχετίζονται περισσότερο με αυτά των HCoV-229E. Ωστόσο, περαιτέρω επιθεώρηση αποκάλυψε έναν υποκλάδο των HCoV-NL63, HCoV-229E και PEDV. Φυλογενετική ανάλυση δεν μπορούσε να πραγματοποιηθεί για τα γονίδια ORF3 και Ε επειδή οι περιοχές ήταν πολύ μεταβλητές ή πολύ μικρές για ανάλυση, αντίστοιχα. Η ανάλυση Bootscan από την έκδοση λογισμικού Simplot 2.5 (αναφ. 28 ) δεν εντόπισε σημάδια ανασυνδυασμού (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).
Πίνακας 2
Ποσοστό ταυτοσημίας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων μεταξύ HCoV-NL63 και άλλων κοροναϊών
Η παρουσία ενός μόνο μη δομικού γονιδίου μεταξύ των γονιδίων S και Ε είναι αξιοσημείωτη επειδή σχεδόν όλοι οι coronaviruses έχουν δύο ή περισσότερα ORF στην περιοχή αυτή, με εξαίρεση τα PEDV και HCoV-OC43 (αναφορές 29 , 30 ). Ίσως το πιο αξιοσημείωτο είναι ένα μεγάλο ένθετο 537 νουκλεοτιδίων στο τμήμα 5 'του γονιδίου S του HcoV-NL63, σε σύγκριση με αυτό του HCoV-229E. Μία έρευνα BLAST δεν βρήκε ομοιότητα μεταξύ αυτού του επιπρόσθετου πεδίου 179 αμινοξέων της πρωτεΐνης S και οποιουδήποτε κορωναϊού ή άλλης αλληλουχίας που κατατέθηκε στο GenBank. Μια ευθυγράμμιση της αλληλουχίας πρωτεΐνης S HCoV-NL63 S με εκείνη άλλων κορωναϊών της ομάδας 1 παρουσιάζεται στο συμπληρωματικό σχήμα 4 online.
Ποσοστό ταυτοσημίας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων μεταξύ HCoV-NL63 και άλλων κοροναϊών
Η παρουσία ενός μόνο μη δομικού γονιδίου μεταξύ των γονιδίων S και Ε είναι αξιοσημείωτη επειδή σχεδόν όλοι οι coronaviruses έχουν δύο ή περισσότερα ORF στην περιοχή αυτή, με εξαίρεση τα PEDV και HCoV-OC43 (αναφορές 29 , 30 ). Ίσως το πιο αξιοσημείωτο είναι ένα μεγάλο ένθετο 537 νουκλεοτιδίων στο τμήμα 5 'του γονιδίου S του HcoV-NL63, σε σύγκριση με αυτό του HCoV-229E. Μία έρευνα BLAST δεν βρήκε ομοιότητα μεταξύ αυτού του επιπρόσθετου πεδίου 179 αμινοξέων της πρωτεΐνης S και οποιουδήποτε κορωναϊού ή άλλης αλληλουχίας που κατατέθηκε στο GenBank. Μια ευθυγράμμιση της αλληλουχίας πρωτεΐνης S HCoV-NL63 S με εκείνη άλλων κορωναϊών της ομάδας 1 παρουσιάζεται στο συμπληρωματικό σχήμα 4 online.
Συζήτηση
Σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζουμε μια λεπτομερή περιγραφή ενός νέου ανθρώπινου κορωναϊού. Μέχρι στιγμής, μόνο τρεις ανθρώπινοι κοροναϊοί έχουν χαρακτηριστεί εάν συμπεριλαμβάνουμε το SARS-CoV. ο περαιτέρω χαρακτηρισμός του HCoV-NL63 ως το τέταρτο μέλος θα παρέχει σημαντική εικόνα για τη μεταβολή των ανθρώπινων κοροναϊών. Το HCoV-NL63 είναι μέλος των κοροναϊών της ομάδας 1 και σχετίζεται περισσότερο με το HCoV-229E, αλλά οι διαφορές μεταξύ τους είναι εμφανείς. Πρώτον, μοιράζονται κατά μέσο όρο μόνο 65% ταυτότητα αλληλουχίας. Δεύτερον, ένα μόνο γονίδιο, ORF3, στο HCoV-NL63 παίρνει τη θέση των γονιδίων 4Α και 4Β του HCoV-229E. Τρίτον, η 5 'περιοχή του γονιδίου S του HCoV-NL63 περιέχει μία μεγάλη εισαγωγή εντός πλαισίου 537 νουκλεοτιδίων. Η Ν-τερματική περιοχή της πρωτεΐνης S εμπλέκεται στη σύνδεση με αμινοπεπτιδάση Ν (κορωναϊοί ομάδας Ι) και σιαλικό οξύ 31, 32 , 33 , έτσι ώστε το ένθεμα 179 αμινοξέων στο HCoV-NL63 να εμπλέκεται στη δέσμευση του υποδοχέα και μπορεί να εξηγήσει τον τροπισμό αυτού του ιού σε κυτταρική καλλιέργεια. Εντούτοις, ο τομέας δεσμεύσεως υποδοχέα αμινοπεπτιδάσης Ν της HCoV-229E S πρωτεΐνης έχει χαρτογραφηθεί στα αμινοξέα (407-547 αναφ. 33 ), έτσι φαίνεται απίθανο ότι η εισαγωγή θα εμπλέκεται άμεσα στη σύνδεση με την αμινοπεπτιδάση Ν. Τέταρτον, ενώ το HCoV-229E είναι ευαίσθητο σε κυτταροκαλλιέργεια με στενή περιοχή ξενιστή, το HCoV-NL63 αντιγράφεται αποτελεσματικά σε κύτταρα νεφρού πιθήκου. Το SARS-CoV είναι επίσης ικανό να αναδιπλασιαστεί σε κύτταρα νεφρού πιθήκου (κύτταρα Vero-E6 34 ), αλλά οι προβλεπόμενες πρωτεΐνες S των SARS-CoV και HCoV-NL63 δεν μοιράζονται τομέα που θα μπορούσε να εξηγήσει in vitroπεριοχή κυττάρων ξενιστή αυτών των ιών. Άλλες πρωτεΐνες του ιού μπορεί να επηρεάσουν τον κυτταρικό τροπισμό ενός ιού, αλλά καμία από τις πρωτεΐνες HCoV-NL63 δεν ήταν πιο στενά συνδεδεμένη με το SARS-CoV παρά με το HCoV-229E.
Η μεταβλητότητα στο 5 'άκρο του γονιδίου S, που συσχετίζεται με αλλοιώσεις στον τροπισμό, έχει επίσης περιγραφεί για τους κοροναϊούς της ομάδας 1 κορεσμοϊού του αναπνευστικού κορώνα χοίρου (PRCoV) και για τον ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας (TGEV). Αυτοί οι ιοί των χοίρων είναι αντιγονικά και γενετικά σχετικοί, αλλά η παθογένεια τους είναι σημαντικά διαφορετική. Το TGEV αναπαράγεται και καταστρέφει τα εντεροκύτταρα του λεπτού εντέρου προκαλώντας σοβαρή διάρροια με υψηλή θνησιμότητα στους νεογέννητους χοίρους. Αντίθετα, το PRCoV (το οποίο εμφανίστηκε πιο πρόσφατα από το TGEV) έχει επιλεκτικό τροπισμό για αναπνευστικό ιστό και πολύ μικρή ικανότητα αντιγραφής στον εντερικό ιστό. Η διαφορά μεταξύ των αλληλουχιών γονιδίων TGEV και PRCoV S είναι συγκρίσιμη με τη διαφορά μεταξύ αυτών των HCoV-NL63 και HCoV-229E 35. Σε σύγκριση με το TGEV, το PRCoV περιέχει μια διαγραφή στην 5 'υπερμεταβλητή περιοχή του γονιδίου S. Η επιπλέον περιοχή που υπάρχει στο 5 'άκρο του γονιδίου S TGEV είναι υπεύθυνη για την ενεργότητα αιμοσυγκολλήσεως του TGEV και την ικανότητά του να συνδέεται με το σιαλικό οξύ 32 . Ωστόσο, αυτή η περιοχή δεν παρουσιάζει ομοιότητα με το ένθετο HCoV-NL63.
Ο κοινός ιός HCoV-229E που προκαλεί κρυολογήματα μπορεί να προκαλέσει πιο σοβαρή αναπνευστική ασθένεια σε βρέφη και ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς 36 , 37 . Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το HCoV-NL63 προκαλεί οξεία αναπνευστική ασθένεια σε παιδιά ηλικίας κάτω του 1 έτους και σε ανοσοκατεσταλμένους ενήλικες. Μέχρι σήμερα, κανένα γνωστό ιικό παθογόνο δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί σε ένα σημαντικό τμήμα αναπνευστικών περιστατικών σε ανθρώπους (20-30%, αριθμός 38 ). Διάφορες δοκιμασίες έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση λοιμώξεων από κοροναϊό. Παραδοσιακά, εφαρμόζεται μια δοκιμασία αντισωμάτων για να μετρηθεί η αύξηση των τίτλων αντισωμάτων έναντι των ανθρώπινων κοροναϊών HCoV-229E ή HCoV-OC43 (αναφ. 12). Τα αντισώματα έναντι του HCoV-NL63 ενδέχεται να αντιδρούν εγκάρσια με HCoV-229E, δεδομένου ότι αυτοί οι ιοί είναι μέλη του ίδιου ορότυπου. Εάν συνέβαινε αυτό, οι HCoV-NL63 μολύνσεις μπορεί να έχουν παρερμηνευθεί εσφαλμένα ως HCoV-229E. Τα εργαλεία μοριακής βιολογίας, όπως οι δοκιμές RT-PCR 39 , 40 σχεδιάστηκαν για την επιλεκτική ανίχνευση των ανθρώπινων κοροναϊών HCoV-229E και HCoV-OC43, αλλά αυτές οι δοκιμασίες δεν θα ανιχνεύσουν HCoV-NL63. Ακόμα και η δοκιμασία RT-PCR που σχεδιάστηκε για να ενισχύσει όλους τους γνωστούς κοροναϊούς 40 δεν είναι ικανή να ενισχύσει HCoV-NL63 λόγω πολλών αναντιστοιχιών με τις αλληλουχίες εκκινητών. Η διαθεσιμότητα της πλήρους αλληλουχίας γονιδιώματος HCoV-NL63 σημαίνει ότι αυτοί οι διαγνωστικοί προσδιορισμοί μπορούν να βελτιωθούν σημαντικά.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το HCoV-NL63 υπάρχει σε σημαντικό αριθμό ασθενειών της αναπνευστικής οδού άγνωστης αιτιολογίας. Το HCoV-NL63 ανιχνεύθηκε σε ασθενείς που πάσχουν από αναπνευστική νόσο, με συχνότητα μέχρι 7% τον Ιανουάριο του 2003. Ο ιός δεν ανιχνεύθηκε σε πιο πρόσφατα δείγματα που συλλέχθηκαν την άνοιξη και το καλοκαίρι του 2003, γεγονός που συσχετίζεται με το γεγονός ότι οι ανθρώπινοι κοροναϊοί τείνουν να μεταδίδονται κατά κύριο λόγο στη χειμερινή περίοδο 12 . Τα μελλοντικά πειράματα με πιο ευαίσθητα διαγνωστικά εργαλεία θα πρέπει να δώσουν μια ακριβέστερη εικόνα του επιπολασμού αυτού του ιού και της σύνδεσής του με την αναπνευστική νόσο.
Σε αυτή τη μελέτη παρουσιάζουμε μια λεπτομερή περιγραφή ενός νέου ανθρώπινου κορωναϊού. Μέχρι στιγμής, μόνο τρεις ανθρώπινοι κοροναϊοί έχουν χαρακτηριστεί εάν συμπεριλαμβάνουμε το SARS-CoV. ο περαιτέρω χαρακτηρισμός του HCoV-NL63 ως το τέταρτο μέλος θα παρέχει σημαντική εικόνα για τη μεταβολή των ανθρώπινων κοροναϊών. Το HCoV-NL63 είναι μέλος των κοροναϊών της ομάδας 1 και σχετίζεται περισσότερο με το HCoV-229E, αλλά οι διαφορές μεταξύ τους είναι εμφανείς. Πρώτον, μοιράζονται κατά μέσο όρο μόνο 65% ταυτότητα αλληλουχίας. Δεύτερον, ένα μόνο γονίδιο, ORF3, στο HCoV-NL63 παίρνει τη θέση των γονιδίων 4Α και 4Β του HCoV-229E. Τρίτον, η 5 'περιοχή του γονιδίου S του HCoV-NL63 περιέχει μία μεγάλη εισαγωγή εντός πλαισίου 537 νουκλεοτιδίων. Η Ν-τερματική περιοχή της πρωτεΐνης S εμπλέκεται στη σύνδεση με αμινοπεπτιδάση Ν (κορωναϊοί ομάδας Ι) και σιαλικό οξύ 31, 32 , 33 , έτσι ώστε το ένθεμα 179 αμινοξέων στο HCoV-NL63 να εμπλέκεται στη δέσμευση του υποδοχέα και μπορεί να εξηγήσει τον τροπισμό αυτού του ιού σε κυτταρική καλλιέργεια. Εντούτοις, ο τομέας δεσμεύσεως υποδοχέα αμινοπεπτιδάσης Ν της HCoV-229E S πρωτεΐνης έχει χαρτογραφηθεί στα αμινοξέα (407-547 αναφ. 33 ), έτσι φαίνεται απίθανο ότι η εισαγωγή θα εμπλέκεται άμεσα στη σύνδεση με την αμινοπεπτιδάση Ν. Τέταρτον, ενώ το HCoV-229E είναι ευαίσθητο σε κυτταροκαλλιέργεια με στενή περιοχή ξενιστή, το HCoV-NL63 αντιγράφεται αποτελεσματικά σε κύτταρα νεφρού πιθήκου. Το SARS-CoV είναι επίσης ικανό να αναδιπλασιαστεί σε κύτταρα νεφρού πιθήκου (κύτταρα Vero-E6 34 ), αλλά οι προβλεπόμενες πρωτεΐνες S των SARS-CoV και HCoV-NL63 δεν μοιράζονται τομέα που θα μπορούσε να εξηγήσει in vitroπεριοχή κυττάρων ξενιστή αυτών των ιών. Άλλες πρωτεΐνες του ιού μπορεί να επηρεάσουν τον κυτταρικό τροπισμό ενός ιού, αλλά καμία από τις πρωτεΐνες HCoV-NL63 δεν ήταν πιο στενά συνδεδεμένη με το SARS-CoV παρά με το HCoV-229E.
Η μεταβλητότητα στο 5 'άκρο του γονιδίου S, που συσχετίζεται με αλλοιώσεις στον τροπισμό, έχει επίσης περιγραφεί για τους κοροναϊούς της ομάδας 1 κορεσμοϊού του αναπνευστικού κορώνα χοίρου (PRCoV) και για τον ιό της μεταδοτικής γαστρεντερίτιδας (TGEV). Αυτοί οι ιοί των χοίρων είναι αντιγονικά και γενετικά σχετικοί, αλλά η παθογένεια τους είναι σημαντικά διαφορετική. Το TGEV αναπαράγεται και καταστρέφει τα εντεροκύτταρα του λεπτού εντέρου προκαλώντας σοβαρή διάρροια με υψηλή θνησιμότητα στους νεογέννητους χοίρους. Αντίθετα, το PRCoV (το οποίο εμφανίστηκε πιο πρόσφατα από το TGEV) έχει επιλεκτικό τροπισμό για αναπνευστικό ιστό και πολύ μικρή ικανότητα αντιγραφής στον εντερικό ιστό. Η διαφορά μεταξύ των αλληλουχιών γονιδίων TGEV και PRCoV S είναι συγκρίσιμη με τη διαφορά μεταξύ αυτών των HCoV-NL63 και HCoV-229E 35. Σε σύγκριση με το TGEV, το PRCoV περιέχει μια διαγραφή στην 5 'υπερμεταβλητή περιοχή του γονιδίου S. Η επιπλέον περιοχή που υπάρχει στο 5 'άκρο του γονιδίου S TGEV είναι υπεύθυνη για την ενεργότητα αιμοσυγκολλήσεως του TGEV και την ικανότητά του να συνδέεται με το σιαλικό οξύ 32 . Ωστόσο, αυτή η περιοχή δεν παρουσιάζει ομοιότητα με το ένθετο HCoV-NL63.
Ο κοινός ιός HCoV-229E που προκαλεί κρυολογήματα μπορεί να προκαλέσει πιο σοβαρή αναπνευστική ασθένεια σε βρέφη και ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς 36 , 37 . Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το HCoV-NL63 προκαλεί οξεία αναπνευστική ασθένεια σε παιδιά ηλικίας κάτω του 1 έτους και σε ανοσοκατεσταλμένους ενήλικες. Μέχρι σήμερα, κανένα γνωστό ιικό παθογόνο δεν μπορεί να ταυτοποιηθεί σε ένα σημαντικό τμήμα αναπνευστικών περιστατικών σε ανθρώπους (20-30%, αριθμός 38 ). Διάφορες δοκιμασίες έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση λοιμώξεων από κοροναϊό. Παραδοσιακά, εφαρμόζεται μια δοκιμασία αντισωμάτων για να μετρηθεί η αύξηση των τίτλων αντισωμάτων έναντι των ανθρώπινων κοροναϊών HCoV-229E ή HCoV-OC43 (αναφ. 12). Τα αντισώματα έναντι του HCoV-NL63 ενδέχεται να αντιδρούν εγκάρσια με HCoV-229E, δεδομένου ότι αυτοί οι ιοί είναι μέλη του ίδιου ορότυπου. Εάν συνέβαινε αυτό, οι HCoV-NL63 μολύνσεις μπορεί να έχουν παρερμηνευθεί εσφαλμένα ως HCoV-229E. Τα εργαλεία μοριακής βιολογίας, όπως οι δοκιμές RT-PCR 39 , 40 σχεδιάστηκαν για την επιλεκτική ανίχνευση των ανθρώπινων κοροναϊών HCoV-229E και HCoV-OC43, αλλά αυτές οι δοκιμασίες δεν θα ανιχνεύσουν HCoV-NL63. Ακόμα και η δοκιμασία RT-PCR που σχεδιάστηκε για να ενισχύσει όλους τους γνωστούς κοροναϊούς 40 δεν είναι ικανή να ενισχύσει HCoV-NL63 λόγω πολλών αναντιστοιχιών με τις αλληλουχίες εκκινητών. Η διαθεσιμότητα της πλήρους αλληλουχίας γονιδιώματος HCoV-NL63 σημαίνει ότι αυτοί οι διαγνωστικοί προσδιορισμοί μπορούν να βελτιωθούν σημαντικά.
Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το HCoV-NL63 υπάρχει σε σημαντικό αριθμό ασθενειών της αναπνευστικής οδού άγνωστης αιτιολογίας. Το HCoV-NL63 ανιχνεύθηκε σε ασθενείς που πάσχουν από αναπνευστική νόσο, με συχνότητα μέχρι 7% τον Ιανουάριο του 2003. Ο ιός δεν ανιχνεύθηκε σε πιο πρόσφατα δείγματα που συλλέχθηκαν την άνοιξη και το καλοκαίρι του 2003, γεγονός που συσχετίζεται με το γεγονός ότι οι ανθρώπινοι κοροναϊοί τείνουν να μεταδίδονται κατά κύριο λόγο στη χειμερινή περίοδο 12 . Τα μελλοντικά πειράματα με πιο ευαίσθητα διαγνωστικά εργαλεία θα πρέπει να δώσουν μια ακριβέστερη εικόνα του επιπολασμού αυτού του ιού και της σύνδεσής του με την αναπνευστική νόσο.
Μέθοδοι
Μέθοδος VIDISCA.
Ο ιός καλλιεργήθηκε σε κύτταρα LLC-ΜΚ2. Λεπτομέρειες σχετικά με την καλλιέργεια ιών και τις περιγραφές των ασθενών είναι διαθέσιμες στο διαδικτυακό συμπληρωματικό υλικό . Για την απομάκρυνση υπολειμμάτων κυττάρων και μιτοχονδρίων, 110 μΐ υπερκείμενου καλλιέργειας ιού περιστράφηκαν για 10 λεπτά σε μέγιστη ταχύτητα (13.500 rpm) σε μικροφυγόκεντρο Eppendorf. Για την αφαίρεση του χρωμοσωμικού DNA και του μιτοχονδριακού ϋΝΑ από τα λυμένα κύτταρα, 100 μΐ υπερκειμένου μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα και κατεργάστηκαν με ϋΝάση Ι για 45 λεπτά στους 37 ° C (Ambion). Τα νουκλεϊκά οξέα εκχυλίστηκαν όπως περιγράφεται στο Σχ. Διεξήχθη αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής με τυχαίους εκκινητές εξαμερούς (Amersham Bioscience) και αντίστροφης τρανσκριπτάσης ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (MMLV-RT, Invitrogen). Η σύνθεση DNA δευτέρου κλώνου πραγματοποιήθηκε με Sequenase II (Amersham Bioscience), χωρίς περαιτέρω προσθήκη ενός εκκινητή. Μια εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου ακολουθήθηκε από καθίζηση με αιθανόλη.
Το cDNA-AFLP εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται 4 , με κάποιες τροποποιήσεις. Το δίκλωνο ϋΝΑ υποβλήθηκε σε πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα Hin ΡΙΙ και ΜδΙΙ (New England Biolabs). Προστέθηκαν στη συνέχεια προσδέματα MseI και Hin ΡΙΙ (βλέπε παρακάτω), μαζί με ένζυμο λιγάσης 5U (Invitrogen) στο παρεχόμενο ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης για 2 ώρες στους 37 ° C. Οι MSE Ι και Hin άγκυρες P1i παρασκευάστηκαν με ανάμιξη ενός ολιγονουκλεοτιδίου top-κλώνου (5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3 'για την MSE άγκυρα Ι και 5'-GACGATGAGTCCTGAC-3' για την Hin άγκυρα P1i) με ένα πυθμένα-κλώνου ολιγονουκλεοτίδιο ( 5'-TAGGTACGCAGTC-3 'για το MseI άγκυρα και 5'-CGGTCAGGACTCAT-3 'για την άγκυρα Hin ΡΙΙ) σε αραίωση 1:40 ρυθμιστικού λιγάσης. Είκοσι κύκλοι PCR διεξήχθησαν με 10 μΐ από το μίγμα σύνδεσης, 100 ng του Hin P1i προτύπου εκκινητή (5'-GACGATGAGTCCTGACCGC-3 ') και 100 ng του MSE Ι προτύπου εκκινητή (5'-CTCGTAGACTGCGTACCTAA-3'). Πέντε μικρολίτρα αυτού του προϊόντος PCR χρησιμοποιήθηκαν ως εισροή στο δεύτερο στάδιο επιλεκτικής ενίσχυσης μαζί με 100 ng Νβ-εκκινητή Hin ΡΙΙ και 100 ng MseΙ Ν-εκκινητήριο μόριο (το 'Ν' υποδηλώνει ότι τα τυποποιημένα εκκινητήρια μόρια επεκτάθηκαν με ένα νουκλεοτίδιο, G, Α, Τ ή C). Οι επιλεκτικοί κύκλοι ενίσχυσης έγιναν με τη χρήση PCR touchdown: 10 κύκλοι 94 ° C για 60 s, 65 ° C για 30 s και 72 ° C για 1 min (θερμοκρασία ανόπτησης μειωμένη κατά 1 ° C ανά κύκλο). 23 κύκλοι των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 1 λεπτό. και τελικά 1 κύκλος στους 72 ° C για 10 λεπτά. Για κάθε δείγμα διεξήχθησαν δεκαέξι αντιδράσεις PCR, καθένα με 1 από τους 16 συνδυασμούς εκκινητών σε αυτή την εκλεκτική PCR. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε 4% πηκτώματα αγαρόζης Metaphor (Cambrex) και τα θραύσματα ενδιαφέροντος κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχίσθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια τερματισμού BigDye. Η ηλεκτροφόρηση και η συλλογή δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση οργάνου ABI 377. Οι δείκτες μοριακού βάρους ϋΝΑ ήταν από την Invitrogen και την Eurogentec.
Για την ανίχνευση του HIV-1, χρησιμοποιήσαμε VIDISCA με Eco πέψη RI αντί Hin πέψης P1i. Το VIDISCA τροποποιήθηκε για ανίχνευση παρβοϊού Β19 ως ακολούθως: αποκλείστηκε το στάδιο ανάστροφης μεταγραφής. μόνο η χώνευση Hin ΡΙΙ και η πρόσδεση προσαρμογέα πραγματοποιήθηκαν. η πρώτη αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε με 35 κύκλους αντί για 20, και τα πρώτα θραύσματα PCR απεικονίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Λεπτομέρειες της κατασκευής της βιβλιοθήκης cDNA και της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος είναι διαθέσιμες στη συμπληρωματική μέθοδο online.
Ο ιός καλλιεργήθηκε σε κύτταρα LLC-ΜΚ2. Λεπτομέρειες σχετικά με την καλλιέργεια ιών και τις περιγραφές των ασθενών είναι διαθέσιμες στο διαδικτυακό συμπληρωματικό υλικό . Για την απομάκρυνση υπολειμμάτων κυττάρων και μιτοχονδρίων, 110 μΐ υπερκείμενου καλλιέργειας ιού περιστράφηκαν για 10 λεπτά σε μέγιστη ταχύτητα (13.500 rpm) σε μικροφυγόκεντρο Eppendorf. Για την αφαίρεση του χρωμοσωμικού DNA και του μιτοχονδριακού ϋΝΑ από τα λυμένα κύτταρα, 100 μΐ υπερκειμένου μεταφέρθηκαν σε ένα νέο σωλήνα και κατεργάστηκαν με ϋΝάση Ι για 45 λεπτά στους 37 ° C (Ambion). Τα νουκλεϊκά οξέα εκχυλίστηκαν όπως περιγράφεται στο Σχ. Διεξήχθη αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής με τυχαίους εκκινητές εξαμερούς (Amersham Bioscience) και αντίστροφης τρανσκριπτάσης ιού λευχαιμίας ποντικού Moloney (MMLV-RT, Invitrogen). Η σύνθεση DNA δευτέρου κλώνου πραγματοποιήθηκε με Sequenase II (Amersham Bioscience), χωρίς περαιτέρω προσθήκη ενός εκκινητή. Μια εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου ακολουθήθηκε από καθίζηση με αιθανόλη.
Το cDNA-AFLP εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται 4 , με κάποιες τροποποιήσεις. Το δίκλωνο ϋΝΑ υποβλήθηκε σε πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα Hin ΡΙΙ και ΜδΙΙ (New England Biolabs). Προστέθηκαν στη συνέχεια προσδέματα MseI και Hin ΡΙΙ (βλέπε παρακάτω), μαζί με ένζυμο λιγάσης 5U (Invitrogen) στο παρεχόμενο ρυθμιστικό διάλυμα λιγάσης για 2 ώρες στους 37 ° C. Οι MSE Ι και Hin άγκυρες P1i παρασκευάστηκαν με ανάμιξη ενός ολιγονουκλεοτιδίου top-κλώνου (5'-CTCGTAGACTGCGTACC-3 'για την MSE άγκυρα Ι και 5'-GACGATGAGTCCTGAC-3' για την Hin άγκυρα P1i) με ένα πυθμένα-κλώνου ολιγονουκλεοτίδιο ( 5'-TAGGTACGCAGTC-3 'για το MseI άγκυρα και 5'-CGGTCAGGACTCAT-3 'για την άγκυρα Hin ΡΙΙ) σε αραίωση 1:40 ρυθμιστικού λιγάσης. Είκοσι κύκλοι PCR διεξήχθησαν με 10 μΐ από το μίγμα σύνδεσης, 100 ng του Hin P1i προτύπου εκκινητή (5'-GACGATGAGTCCTGACCGC-3 ') και 100 ng του MSE Ι προτύπου εκκινητή (5'-CTCGTAGACTGCGTACCTAA-3'). Πέντε μικρολίτρα αυτού του προϊόντος PCR χρησιμοποιήθηκαν ως εισροή στο δεύτερο στάδιο επιλεκτικής ενίσχυσης μαζί με 100 ng Νβ-εκκινητή Hin ΡΙΙ και 100 ng MseΙ Ν-εκκινητήριο μόριο (το 'Ν' υποδηλώνει ότι τα τυποποιημένα εκκινητήρια μόρια επεκτάθηκαν με ένα νουκλεοτίδιο, G, Α, Τ ή C). Οι επιλεκτικοί κύκλοι ενίσχυσης έγιναν με τη χρήση PCR touchdown: 10 κύκλοι 94 ° C για 60 s, 65 ° C για 30 s και 72 ° C για 1 min (θερμοκρασία ανόπτησης μειωμένη κατά 1 ° C ανά κύκλο). 23 κύκλοι των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, 56 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 1 λεπτό. και τελικά 1 κύκλος στους 72 ° C για 10 λεπτά. Για κάθε δείγμα διεξήχθησαν δεκαέξι αντιδράσεις PCR, καθένα με 1 από τους 16 συνδυασμούς εκκινητών σε αυτή την εκλεκτική PCR. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε 4% πηκτώματα αγαρόζης Metaphor (Cambrex) και τα θραύσματα ενδιαφέροντος κλωνοποιήθηκαν και αλληλουχίσθηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια τερματισμού BigDye. Η ηλεκτροφόρηση και η συλλογή δεδομένων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση οργάνου ABI 377. Οι δείκτες μοριακού βάρους ϋΝΑ ήταν από την Invitrogen και την Eurogentec.
Για την ανίχνευση του HIV-1, χρησιμοποιήσαμε VIDISCA με Eco πέψη RI αντί Hin πέψης P1i. Το VIDISCA τροποποιήθηκε για ανίχνευση παρβοϊού Β19 ως ακολούθως: αποκλείστηκε το στάδιο ανάστροφης μεταγραφής. μόνο η χώνευση Hin ΡΙΙ και η πρόσδεση προσαρμογέα πραγματοποιήθηκαν. η πρώτη αντίδραση PCR πραγματοποιήθηκε με 35 κύκλους αντί για 20, και τα πρώτα θραύσματα PCR απεικονίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Λεπτομέρειες της κατασκευής της βιβλιοθήκης cDNA και της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματος είναι διαθέσιμες στη συμπληρωματική μέθοδο online.
Διαγνωστική RT-PCR.
Συνολικά, 614 αναπνευστικά δείγματα συλλέχθηκαν από 493 άτομα μεταξύ Δεκεμβρίου 2002 και Αυγούστου 2003 στο Ακαδημαϊκό Ιατρικό Κέντρο του Άμστερνταμ. Τα δείγματα περιελάμβαναν στοματικά και ρινοφαρυγγικά αναρροφήματα, επιχρίσματα στο λαιμό, βρογχοκυψελιδική πλύση και πτύελα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν για διαγνωστικούς ελέγχους ρουτίνας για άτομα που πάσχουν από ασθένειες ανώτερης και / ή κατώτερης αναπνευστικής οδού και οι ασθενείς συμφώνησαν ότι τα δείγματα τους θα χρησιμοποιηθούν για τη δοκιμή αναπνευστικών ιών που περιλαμβάνουν κοροναϊούς. Χρησιμοποιήσαμε 100 μΐ από κάθε δείγμα σε μία εκχύλιση με Boom 41. Η διαγνωστική δοκιμασία σχεδιάστηκε με βάση την αλληλουχία του 1b γονιδίου. Η αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε με MMLV-RT (Invitrogen), χρησιμοποιώντας 10 ng εκκινητή ανάστροφης μεταγραφής (repSZ-RT, 5'-CCACTATAAC-3 ', συντεταγμένη 16232 σε HCoV-NL63). Το πλήρες μίγμα ανάστροφης μεταγραφής προστέθηκε στο πρώτο μίγμα PCR που περιείχε 100 ng εκκινητή repSZ-1 (5'-GTGATGCATATGCTAATTTG-3 ', συνάρτηση 15973) και 100 ng εκκινητή repSZ-3 (5'-CTCTTGCAGGTATAATCCTA-3' 16210). Η αντίδραση PCR συνίστατο από τα ακόλουθα στάδια: 95 ° C για 5 λεπτά, τότε 35 κύκλοι 95 ° C για 1 λεπτό, 55 ° C για 1 λεπτό και 72 ° C για 2 λεπτά. κατόπιν 72 ° C για 10 λεπτά.
Έγινε έναρξη μίας ένθετης PCR χρησιμοποιώντας 5 μΐ του πρώτου προϊόντος PCR με 100 ng εκκινητή repSZ-2 (5'-TTGGTAAACAAAAGATAACT-3 ', συντονισμένη 16012) και 100 ng εκκινητή repSZ-4 (5'-TCAATGCTATAAACAGTCAT-3'; συντονισμός 16181). Διεξήχθησαν 25 κύκλοι PCR χρησιμοποιώντας το ίδιο προφίλ με την πρώτη PCR. Δέκα μικρόλιτρα εκάστου προϊόντος PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Όλα τα θετικά δείγματα επαναλήφθηκαν και προσδιορίσθηκε η αλληλουχία τους για να επιβεβαιωθεί η παρουσία HCoV-NL63. Για την επαλήθευση αρνητικών και θετικών αποτελεσμάτων PCR διεξήχθη ένας πρόσθετος διαγνωστικός προσδιορισμός RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές γονιδίου Ια 5'-ΑΑΤΑΤGΤΟΤΑΑΑΑΑΤΑΑΑΑΟΟΑΤΤ-3 '(εκκινητής ανάστροφης μεταγραφάσης Ρ4Η10-3, συντονισμός 6667), 5'-CTTTTGATAACGGTCACTATG-3' 5852-5Ρ, συντετμημένη 5777) και 5'-CTCATTACATAAAACATCAAACGG-3 '(P4G1M-5-3Ρ, συντεταγμένη 6616) στην πρώτη PCR. και 5'-GGTCACTATGTAGTTTATGATG-3 '(Ρ3Ε2-5Ρ; συντεταγμένη 5788) και 5'-GGATTTTTCATAACCACTTAC-3 '(SS 6375-3Ρ, συντετμημένη τιμή 6313) στην ένθετη PCR. Λεπτομέρειες της ανάλυσης αλληλουχίας είναι διαθέσιμα στο Συμπληρωματικές μέθοδοι online.
Συνολικά, 614 αναπνευστικά δείγματα συλλέχθηκαν από 493 άτομα μεταξύ Δεκεμβρίου 2002 και Αυγούστου 2003 στο Ακαδημαϊκό Ιατρικό Κέντρο του Άμστερνταμ. Τα δείγματα περιελάμβαναν στοματικά και ρινοφαρυγγικά αναρροφήματα, επιχρίσματα στο λαιμό, βρογχοκυψελιδική πλύση και πτύελα. Τα δείγματα συλλέχθηκαν για διαγνωστικούς ελέγχους ρουτίνας για άτομα που πάσχουν από ασθένειες ανώτερης και / ή κατώτερης αναπνευστικής οδού και οι ασθενείς συμφώνησαν ότι τα δείγματα τους θα χρησιμοποιηθούν για τη δοκιμή αναπνευστικών ιών που περιλαμβάνουν κοροναϊούς. Χρησιμοποιήσαμε 100 μΐ από κάθε δείγμα σε μία εκχύλιση με Boom 41. Η διαγνωστική δοκιμασία σχεδιάστηκε με βάση την αλληλουχία του 1b γονιδίου. Η αντίστροφη μεταγραφή εκτελέστηκε με MMLV-RT (Invitrogen), χρησιμοποιώντας 10 ng εκκινητή ανάστροφης μεταγραφής (repSZ-RT, 5'-CCACTATAAC-3 ', συντεταγμένη 16232 σε HCoV-NL63). Το πλήρες μίγμα ανάστροφης μεταγραφής προστέθηκε στο πρώτο μίγμα PCR που περιείχε 100 ng εκκινητή repSZ-1 (5'-GTGATGCATATGCTAATTTG-3 ', συνάρτηση 15973) και 100 ng εκκινητή repSZ-3 (5'-CTCTTGCAGGTATAATCCTA-3' 16210). Η αντίδραση PCR συνίστατο από τα ακόλουθα στάδια: 95 ° C για 5 λεπτά, τότε 35 κύκλοι 95 ° C για 1 λεπτό, 55 ° C για 1 λεπτό και 72 ° C για 2 λεπτά. κατόπιν 72 ° C για 10 λεπτά.
Έγινε έναρξη μίας ένθετης PCR χρησιμοποιώντας 5 μΐ του πρώτου προϊόντος PCR με 100 ng εκκινητή repSZ-2 (5'-TTGGTAAACAAAAGATAACT-3 ', συντονισμένη 16012) και 100 ng εκκινητή repSZ-4 (5'-TCAATGCTATAAACAGTCAT-3'; συντονισμός 16181). Διεξήχθησαν 25 κύκλοι PCR χρησιμοποιώντας το ίδιο προφίλ με την πρώτη PCR. Δέκα μικρόλιτρα εκάστου προϊόντος PCR αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Όλα τα θετικά δείγματα επαναλήφθηκαν και προσδιορίσθηκε η αλληλουχία τους για να επιβεβαιωθεί η παρουσία HCoV-NL63. Για την επαλήθευση αρνητικών και θετικών αποτελεσμάτων PCR διεξήχθη ένας πρόσθετος διαγνωστικός προσδιορισμός RT-PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές γονιδίου Ια 5'-ΑΑΤΑΤGΤΟΤΑΑΑΑΑΤΑΑΑΑΟΟΑΤΤ-3 '(εκκινητής ανάστροφης μεταγραφάσης Ρ4Η10-3, συντονισμός 6667), 5'-CTTTTGATAACGGTCACTATG-3' 5852-5Ρ, συντετμημένη 5777) και 5'-CTCATTACATAAAACATCAAACGG-3 '(P4G1M-5-3Ρ, συντεταγμένη 6616) στην πρώτη PCR. και 5'-GGTCACTATGTAGTTTATGATG-3 '(Ρ3Ε2-5Ρ; συντεταγμένη 5788) και 5'-GGATTTTTCATAACCACTTAC-3 '(SS 6375-3Ρ, συντετμημένη τιμή 6313) στην ένθετη PCR. Λεπτομέρειες της ανάλυσης αλληλουχίας είναι διαθέσιμα στο Συμπληρωματικές μέθοδοι online.
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου