Κορονοιος ΕΡ 3172319Β1
Ευρωπαϊκό Γραφείο Ευρεσιτεχνιών
- Εφευρέτης
- Erica Bickerton
- Σάρα Κ.Ε.Ε.Π Paul Britton
- Τρέχων αποδέκτης
- Ινστιτούτο Pirbright Pirbright Inst
- ΠΕΔΙΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ
[0001]
ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΕΩΣ
[0002]
Ο ιός της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών (IBV), ο αιτιολογικός παράγοντας της μολυσματικής βρογχίτιδας (ΙΒ), είναι ένα εξαιρετικά μολυσματικό και μεταδοτικό παθογόνο οικόσιτων ορνίθων που αναπαράγεται κυρίως στην αναπνευστική οδό, αλλά και σε επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου, των νεφρών και των ωοθηκών. Το IBV είναι μέλος του Τάγματος Nidovirales , Οικογένεια Coronaviridae, Υποοικογένεια Coronavirinae και Genus Gammacororavirus , γενετικά πολύ παρόμοιοι κοροναϊοί προκαλούν ασθένεια σε γαλοπούλες, φραγκόκοτες και φασιανούς.
[0003]
Τα κλινικά συμπτώματα της ΙΒ περιλαμβάνουν φτέρνισμα, τραχειακές ουλές, ρινική έκκριση και συριγμό. Τα πτηνά τύπου κρέατος έχουν μειωμένο κέρδος βάρους, ενώ τα πτηνά που ωοτόκουν τα αυγά φέρουν λιγότερα αυγά και παράγουν αυγά χαμηλής ποιότητας. Η λοίμωξη του αναπνευστικού
προσδίδει στα κοτόπουλα δευτερογενείς βακτηριακές λοιμώξεις που μπορεί να είναι θανατηφόρες σε νεοσσούς. Ο ιός μπορεί επίσης να προκαλέσει μόνιμη βλάβη στον ωαγωγό, ειδικά σε νεοσσούς, με αποτέλεσμα τη μείωση της παραγωγής και της ποιότητας των αυγών. και νεφρών, μερικές φορές οδηγώντας σε νεφρική νόσο που μπορεί να είναι θανατηφόρα.
[0004]
Το IBV έχει αναφερθεί ότι είναι υπεύθυνο για περισσότερες οικονομικές απώλειες στη βιομηχανία πουλερικών από οποιαδήποτε άλλη μολυσματική ασθένεια. Αν και τα ζώντα εξασθενημένα εμβόλια και τα απενεργοποιημένα εμβόλια χρησιμοποιούνται παγκοσμίως στον έλεγχο του IBV, η προστασία που αποκτάται με τη χρήση του εμβολιασμού μπορεί να χαθεί είτε λόγω διακοπής εμβολίου είτε με την εισαγωγή ενός νέου ορότυπου IBV που δεν σχετίζεται με το εμβόλιο που χρησιμοποιήθηκε, κινδύνου για τη βιομηχανία πουλερικών.
[0005]
Περαιτέρω, υπάρχει ανάγκη στην βιομηχανία να αναπτυχθούν εμβόλια κατάλληλα για χρήση σε ovo, προκειμένου να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα και η αποδοτικότητα των προγραμμάτων εμβολιασμού. Μια μείζων πρόκληση που σχετίζεται με τον εμβολιασμό in ovo είναι ότι ο ιός πρέπει να είναι ικανός να αντιγράφεται παρουσία μητρικών αντισωμάτων έναντι του ιού χωρίς να είναι παθογόνος για το έμβρυο. Τα τρέχοντα εμβόλια IBV προέρχονται από πολλαπλή διέλευση σε εμβρυϊκά αυγά, με αποτέλεσμα ιούς με μειωμένη παθογένεια για τα κοτόπουλα, έτσι ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ζώντα εξασθενημένα εμβόλια. Ωστόσο, αυτοί οι ιοί σχεδόν πάντα παρουσιάζουν αυξημένη λοιμογόνο δράση στα έμβρυα και συνεπώς δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για in ovoεμβολιασμό καθώς προκαλούν μειωμένη εκκόλαψη. Σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρείται μείωση κατά 70% της ελαιοκομίας.
[0006]
Η εξασθένηση μετά από πολλαπλή διέλευση σε εμβρυϊκά αυγά πάσχει επίσης από άλλα μειονεκτήματα. Είναι μια εμπειρική μέθοδος, καθώς η εξασθένηση των ιών είναι τυχαία και θα διαφέρει κάθε φορά που περνάει ο ιός, οπότε η διέλευση του ίδιου ιού μέσω μιας διαφορετικής σειράς αυγών για σκοπούς εξασθένησης θα οδηγήσει σε μια διαφορετική σειρά μεταλλάξεων που οδηγούν σε εξασθένηση. Υπάρχουν επίσης προβλήματα αποτελεσματικότητας που σχετίζονται με τη διαδικασία: μερικές μεταλλάξεις θα επηρεάσουν την αναπαραγωγή του ιού και μερικές από τις μεταλλάξεις μπορεί να κάνουν τον ιό πάρα πολύ εξασθενημένο. Μεταλλάξεις μπορούν επίσης να εμφανιστούν στο γονίδιο S που μπορεί επίσης να επηρεάσει την ανοσογονικότητα έτσι ώστε να επηρεαστεί η επιθυμητή ανοσολογική απόκριση και το πιθανό εμβόλιο να μην προστατεύει από τον απαιτούμενο ορότυπο. Επιπλέον, υπάρχουν προβλήματα που σχετίζονται με την αναστροφή στη λοιμοτοξικότητα και τη σταθερότητα των εμβολίων.
[0007]
Menachery, VD et αϊ. (2014) J. Virol., Vol. 88, όχι. 8, 4251-4264 , WO 2005/049814 Α2 και WO 2004/092360 έχει ήδη αποκαλυφθεί ένας κοροναϊός που περιλαμβάνει μια μετάλλαξη στα nsp-15 και nsp-16 καθώς και μέσα και μεθόδους για τον τρόπο επίτευξης ενός κορωναϊού που περιλαμβάνει τέτοιες μεταλλαγμένες δομικές πρωτεΐνες.
[0008]
Είναι σημαντικό να αναπτυχθούν νέα και ασφαλέστερα εμβόλια για τον έλεγχο του IBV. Συνεπώς, υπάρχει ανάγκη για εμβόλια IBV που δεν σχετίζονται με αυτά τα θέματα, ιδιαίτερα εμβόλια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για εμβολιασμό in ovo .
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙΚΕΙΜΕΝΩΝ ΤΗΣ ΕΦΕΥΡΕΣΗΣ
[0009]
Οι παρόντες εφευρέτες έχουν χρησιμοποιήσει μια προσέγγιση αντίστροφης γενετικής προκειμένου να εξασθενίσουν ορθολογικά το IBV. Αυτή η προσέγγιση είναι πολύ πιο ελεγχόμενη από την τυχαία εξασθένηση μετά από πολλαπλές διελεύσεις σε εμβρυϊκά αυγά επειδή η θέση κάθε μετάλλαξης είναι γνωστή και μπορεί να προκύψει η επίδρασή της στον ιό, δηλαδή ο λόγος της εξασθένησης.
[0010]
Χρησιμοποιώντας την αντίστροφη γενετική προσέγγισή τους, οι παρόντες εφευρέτες έχουν εντοπίσει διάφορες μεταλλάξεις που προκαλούν τον ιό να έχει μειωμένα επίπεδα παθογονικότητας. Τα επίπεδα της παθογονικότητας μπορούν να μειωθούν έτσι ώστε όταν ο ιός χορηγείται σε ένα εμβρυϊκό αυγό, είναι ικανό να αναδιπλασιαστεί χωρίς να είναι παθογόνο στο έμβρυο. Αυτοί οι ιοί μπορεί να είναι κατάλληλοι για εμβολιασμό in ovo , ο οποίος είναι ένα σημαντικό πλεονέκτημα και έχει βελτίωση έναντι των εξασθενημένων εμβολίων IBV που παράγονται μετά από πολλαπλή διέλευση σε εμβρυϊκά αυγά.
[0011]
Έτσι, σε μια πρώτη άποψη, η παρούσα εφεύρεση παρέχει ένα ζωντανό εξασθενημένο κοροναϊό που περιλαμβάνει ένα παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης που κωδικοποιεί πολυπρωτεΐνες που περιλαμβάνουν μια μετάλλαξη στο nsp-14, όπου το γονίδιο παραλλαγμένης ρεπλικάσης κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μετάλλαξη αμινοξέος Val σε Leu στη θέση που αντιστοιχεί στη θέση 393 της SEQ ID ΝΟ: 7.
[0012]
Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί περαιτέρω να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μία ή περισσότερες μεταλλάξεις αμινοξέων που επιλέγονται από τον κατάλογο:
- Pro προς Leu στη θέση 85 της SEQ ID ΝΟ: 6,
- Leu να βρίσκεται στη θέση 183 της αλληλουχίας αρ. 8,
- Val να βρίσκεται στη θέση 209 της αλληλουχίας αρ. 9.
[0013]
Το γονίδιο της ρεπλικάσης μπορεί περαιτέρω να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει την μετάλλαξη αμινοξέων Pro σε Leu στη θέση 85 της αλληλουχίας αρ. 6.
[0014]
Το γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει τις μεταλλάξεις αμινοξέων Val προς Leu στη θέση 393 της αλληλουχίας αρ. 7, το Leu να βρίσκεται στη θέση 183 της αλληλουχίας αρ. 8, και Val να βρίσκεται στη θέση 209 της αλληλουχίας αρ. 9.
[0015]
Το γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει τις μεταλλάξεις αμινοξέων Pro προς Leu στη θέση 85 της αλληλουχίας αρ. 6, Val προς Leu στη θέση 393 της SEQ ID ΝΟ: 7, Leu να βρίσκεται στη θέση 183 της αλληλουχίας αρ. 8, και Val να βρίσκεται στη θέση 209 της αλληλουχίας αρ. 9.
[0016]
Το γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί να περιλαμβάνει μία ή περισσότερες υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων που επιλέγονται από τον κατάλογο:
- C έως Τ στη νουκλεοτιδική θέση 12137,
- G έως C σε θέση νουκλεοτιδίου 18114,
- Τ προς Α στη θέση νουκλεοτιδίου 19047, και
- G προς Α σε νουκλεοτιδική θέση 20139,
- σε σύγκριση με την αλληλουχία που δείχνεται ως αλληλουχία αρ. 1.
[0017]
Ο κορωναϊός μπορεί να είναι ένας ιός μολυσματικής βρογχίτιδας (IBV).
[0018]
Ο κορωναϊός μπορεί να είναι ΙΒν Μ41.
[0019]
Ο κορωναϊός μπορεί να περιλαμβάνει μια πρωτεΐνη S τουλάχιστον ένα μέρος της οποίας προέρχεται από έναν ορότυπο IBV διαφορετικό από τον Μ41.
[0020]
Για παράδειγμα, η υπομονάδα S1 ή ολόκληρη η πρωτεΐνη S μπορεί να είναι από έναν ορότυπο IBV διαφορετικό από τον Μ41.
[0021]
Ο κορωναϊός σύμφωνα με την πρώτη άποψη έχει μειώσει την παθογονικότητα σε σύγκριση με έναν κοροναϊό που εκφράζει μια αντίστοιχη αγρίου τύπου ρεπλικάση, έτσι ώστε όταν ο ιός χορηγείται σε ένα εμβρυοποιημένο ωάριο, είναι ικανό να αναδιπλασιαστεί χωρίς να είναι παθογόνο στο έμβρυο.
[0022]
Σε μια δεύτερη άποψη, παρέχεται ένα παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης όπως ορίζεται στις αξιώσεις.
[0023]
Σε μια τρίτη άποψη, παρέχεται μία πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από ένα γονίδιο ρεπλικάσης παραλλαγμένου κορονάριου όπως ορίζεται στις αξιώσεις.
[0024]
Σε μια τέταρτη άποψη, παρέχεται ένα πλασμίδιο που περιλαμβάνει ένα γονίδιο ρεπλικάσης όπως ορίζεται στις αξιώσεις.
[0025]
Σε μια πέμπτη άποψη, παρέχεται μια μέθοδος για την κατασκευή του κοροναϊού όπως ορίζεται στις αξιώσεις η οποία περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια:
- (ί) διαμόλυνση ενός πλασμιδίου σύμφωνα με την τέταρτη άποψη της εφεύρεσης σε ένα κύτταρο ξενιστή,
- (ϋ) μόλυνση του κυττάρου ξενιστή με έναν ανασυνδυασμένο ιό που περιλαμβάνει το γονιδίωμα ενός στελέχους κορωνοϊού με ένα γονίδιο ρεπλικάσης,
- (ίϋ) επιτρέποντας την εμφάνιση ομόλογου ανασυνδυασμού μεταξύ των αλληλουχιών γονιδίου ρεπλικάσης στο πλασμίδιο και των αντίστοιχων αλληλουχιών στο γονιδίωμα ανασυνδυασμού του ιού για παραγωγή ενός τροποποιημένου γονιδίου ρεπλικάσης, και
- (ίν) επιλογή για ανασυνδυασμό ιού που περιλαμβάνει το τροποποιημένο γονίδιο ρεπλικάσης.
[0026]
Ο ανασυνδυασμένος ιός μπορεί να είναι ένας ιός δαμαλίτιδας.
[0027]
Η μέθοδος μπορεί επίσης να περιλαμβάνει το στάδιο:
(ν) ανάκτηση ανασυνδυασμένου κοροναϊού που περιλαμβάνει το τροποποιημένο γονίδιο ρεπλικάσης από το DNA από τον ανασυνδυασμένο ιό από το στάδιο (ίν).
[0028]
Ένα κύτταρο ικανό να παράγει κοροναϊό σύμφωνα με την πρώτη άποψη παρέχεται.
[0029]
Σε μία άλλη άποψη, παρέχεται ένα εμβόλιο που περιλαμβάνει κορωναϊό όπως ορίζεται στις αξιώσεις και φαρμακευτικώς αποδεκτό φορέα.
[0030]
Επίσης περιγράφεται εδώ μια μέθοδος θεραπείας και / ή πρόληψης ασθένειας σε ένα υποκείμενο που περιλαμβάνει το στάδιο της χορήγησης ενός εμβολίου σύμφωνα με την εφεύρεση στο άτομο.
[0031]
Περαιτέρω απόψεις της εφεύρεσης παρέχουν:
- το εμβόλιο όπως ορίζεται στις αξιώσεις για χρήση στην πρόληψη ασθένειας σε ένα υποκείμενο.
[0032]
Επίσης περιγράφεται εδώ η χρήση ενός κοροναϊού σύμφωνα με την πρώτη άποψη στην παρασκευή ενός εμβολίου για τη θεραπεία και / ή την πρόληψη μιας ασθένειας σε ένα υποκείμενο.
[0033]
Η ασθένεια μπορεί να είναι μολυσματική βρογχίτιδα (IB).
[0034]
Η μέθοδος χορήγησης του εμβολίου μπορεί να επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από: χορήγηση οφθαλμικών σταγόνων, ενδορινική χορήγηση, χορήγηση πόσιμου ύδατος, ένεση μετά την εκκόλαψη και ένεση in ovo .
[0035]
Ο εμβολιασμός μπορεί να γίνεται με εμβολιασμό in ovo .
[0036]
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης μια μέθοδο για την παραγωγή ενός εμβολίου όπως ορίζεται στις αξιώσεις που περιλαμβάνει το στάδιο μολύνσεως ενός κυττάρου όπως ορίζεται στις αξιώσεις με έναν κοροναϊό όπως ορίζεται στις αξιώσεις.
ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ ΤΩΝ ΣΧΗΜΑΤΩΝ
[0037]
Φιγούρα 1 - Κινητική ανάπτυξη των M41-R-6 και M41-R-12 σε σύγκριση με το M41-CK (M41 ΕΡ4) σε κύτταρα CKΣχήμα 2 - Κλινικά σημάδια, χτύπημα και συριγμός, που σχετίζονται με τα Μ41-R-6 και M41-R-12 σε σύγκριση με τα M41-CK (M41 EP4) και Beau-R (Μπάρα παρουσιάζουν ψευδαισθήσεις Beau-R, M41-R6, R 12, M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 3 - Ακτινωτή δραστηριότητα των ιών στους τραχειακούς δακτυλίους που απομονώνονται από τραχεία που λαμβάνονται από μολυσμένες νεοσσοί. Η ακτινοβολία 100% δεικνύει καμία επίδραση από τον ιό. (Bars show fake, Beau-R, M41-R6, M41-R12, M41-CK ΕΡ4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου ).Σχήμα 4 - Κλινικά συμπτώματα, αιμορραγία, που σχετίζονται με τα M41R-nsp10rep και M41R-nsp14,15,16rep σε σύγκριση με τα M41-R-12 και M41-CK (Μ41 ΕΡ5) (Οι ράβδοι δείχνουν ψεύτικες, M41-R12, M41R-nsp10rep, M41R -nsp14,15,16rep και M41-CK EP5 από τα αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 5 - Η ακτινωτή δραστηριότητα των M41R-nsp10rep και M41R-nsp14,15,16rep σε σύγκριση με τα Μ41-R-12 και M41-CK σε τραχειακούς δακτυλίους που απομονώθηκαν από τραχεία που ελήφθησαν από μολυσμένες νεοσσοί (Μάρκες παρουσιάζουν ψεύτικα, M41-R12, M41R-nsp10rep, M41R -nsp14,15,16rep και M41-CK EP5 από τα αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 6 - Κλινικά συμπτώματα που σχετίζονται με τα M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10,15,16rep και M41-K σε σύγκριση με το M41-CK M41R-nsp10,15rep1 · M41R-nsp10,14,16rep4 · M41R-nsp10,15,16rep8 · M41R-nsp10,14,15rep10 · M41-K6 και M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά για κάθε χρονικό σημείο).Σχήμα 7 - Κλινικά συμπτώματα, συριγμό, που συνδέονται με τα M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp1 0, 15, 16rep και M41-K σε σύγκριση με M41-CK δείχνουν ψεύτικα, M41R-nsp10,15rep1 · M41R-nsp10,14,16rep4 · M41R-nsp10,15,16rep8 · M41R-nsp10,14,15rep10 · M41-K6 και M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 8 - Η ακτινωτή δραστηριότητα των M41R-nsp1 0, 15rep, M41R-nsp1 0, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep και M41-K σε σύγκριση με το M41-CK σε τραχειακούς δακτυλίους απομονωμένους από τραχεία που ελήφθησαν από μολυνθέντες νεοσσούς (οι ράβδοι δείχνουν ψεύτικα, M41R-nsp10,15rep1 · M41R-nsp10,14,16rep4 · M41R-nsp10,15,16rep8 · M41R-nsp10,14,15rep10 · M41-K6 και M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 9 - Κινητική ανάπτυξη των rIBVs σε σύγκριση με το M41-CK σε κύτταρα CK. Σχήμα 9Α δείχνει τα αποτελέσματα για τα M41-R και M41-K. Σχ. 9Β δείχνει τα αποτελέσματα για τον M41-nsp10 rep. M41 R-nsp14, 15, 16 rep; M41 R-nsp1 0, 15 rep. M41 R-nsp10, 15, 16 rep; M41R-nsp10, 14, 15 rep. και M41R-nsp10, 14, 16.Σχήμα 10 - Θέση μεταλλάξεων αμινοξέων σε μεταλλαγμένες αλληλουχίες nsp10, nsp14, nsp15 και nsp16.Σχήμα 11 - Α) Χτύπημα. Β) Συμπτώματα του αναπνευστικού συστήματος (συριγμός και συσπάσματα συνδυασμένα) και C) Ακτινωτή δραστηριότητα του rIBV M41R-nsp10,14 rep και rIBV M41R-nsp10,16 rep σε σύγκριση με το Μ41-CK (Οι ράβδοι δείχνουν εικονικές, M41R-nsp10,14rep · M41R-nsp10 , 16rep και M41-K από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).
ΛΕΠΤΟΜΕΡΗΣ ΠΕΡΙΓΡΑΦΗ
[0038]
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει έναν κορωναϊό που περιλαμβάνει ένα γονίδιο παραλλαγής ρεπλικάσης το οποίο, όταν εκφράζεται στον κορωναϊό, προκαλεί τον ιό να έχει μειωμένη παθογονικότητα σε σύγκριση με έναν αντίστοιχο κοροναϊό ο οποίος περιλαμβάνει το γονίδιο ρεπλικάσης άγριου τύπου.
CORONAVIRUS
[0039]
Ο ιός Gammacoron είναι ένα γένος του ζωικού ιού που ανήκει στην οικογένεια Coronaviridae. Οι κορωναϊοί είναι επικαλυμμένοι ιοί με γονιδίωμα RNA μονού κλώνου θετικής λογικής και ελικοειδής συμμετρία.
[0040]
Το γονιδιωματικό μέγεθος των κοροναϊών κυμαίνεται από περίπου 27 έως 32 kilobases, το οποίο είναι το μακρύτερο μέγεθος για οποιοδήποτε γνωστό ιό RNA.
[0041]
Οι κορωναϊοί μολύνουν κυρίως την ανώτερη αναπνευστική ή γαστρεντερική οδό θηλαστικών και πτηνών. Πέντε έως έξι διαφορετικά επί του παρόντος γνωστά στελέχη κοροναϊών μολύνουν ανθρώπους. Ο πιο δημοφιλής ανθρώπινος κοροναϊός, το SARS-CoV που προκαλεί σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS), έχει μια μοναδική παθογένεια επειδή προκαλεί και λοιμώξεις του ανώτερου και του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος και μπορεί επίσης να προκαλέσει γαστρεντερίτιδα. Το κορωναϊό του αναπνευστικού συνδρόμου στη Μέση Ανατολή (MERS-CoV) προκαλεί επίσης μια λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος στον άνθρωπο. Οι κοροναϊοί πιστεύεται ότι προκαλούν σημαντικό ποσοστό όλων των συνήθων κρυολογήσεων σε ανθρώπους ενήλικες.
[0042]
Οι κοροναϊοί προκαλούν επίσης μια σειρά ασθενειών σε ζώα και κατοικίδια κατοικίδια ζώα, μερικά από τα οποία μπορεί να είναι σοβαρά και αποτελούν απειλή για τη γεωργική βιομηχανία. Οι οικονομικά σημαντικοί κοροναϊοί των ζώων κτηνοτροφίας περιλαμβάνουν τον ιό της μολυσματικής βρογχίτιδας (IBV), ο οποίος προκαλεί κυρίως αναπνευστική νόσο στα κοτόπουλα και επηρεάζει σοβαρά τη βιομηχανία πουλερικών παγκοσμίως. κοροναϊό χοίρου (μεταδοτική γαστρεντερίτιδα, TGE) και κορωναϊού βοοειδών, τα οποία οδηγούν σε διάρροια σε νεαρά ζώα. Ο κορωναϊός από γάτα έχει δύο μορφές, ο εντερικός κοροναϊός αιλουροειδών είναι ένας παθογόνος παράγοντας με μικρή κλινική σημασία, αλλά η αυθόρμητη μετάλλαξη αυτού του ιού μπορεί να οδηγήσει σε λοιμώδη περιτονίτιδα της γάτας (FIP), μια ασθένεια που σχετίζεται με υψηλή θνησιμότητα.
[0043]
Υπάρχουν επίσης δύο τύποι κορώνων ιού σκύλου (CCoV), ένας που προκαλεί ήπια γαστρεντερική νόσο και ένας που έχει βρεθεί ότι προκαλεί αναπνευστική νόσο. Ο ιός της ηπατίτιδας του ποντικιού (MHV) είναι ένας κορωναϊός που προκαλεί επιδημική ασθένεια ποντικού με υψηλή θνησιμότητα, ειδικά μεταξύ αποικιών εργαστηριακών ποντικών.
[0044]
Οι κορωναϊοί χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες, όπως φαίνεται παρακάτω:
- Αλφα
- Ο κορωναϊός του σκύλου (CCoV)
- Κορωναϊός από γάτα (FeCoV)
- Ο ανθρώπινος κοροναϊός 229Ε (HCoV-229Ε)
- Ο ιός της διάρροιας των επιδημικών χοίρων (PEDV)
- Ο μεταδοτικός ιός της γαστρεντερίτιδας (TGEV)
- Ανθρώπινο κορωναϊό NL63 (NL ή New Haven)
- Βήτα
- Ο κοροναϊός των βοοειδών (BCoV)
- Κορνοϊός του αναπνευστικού σκύλου (CRCoV) - Κοινός στη ΝΑ Ασία και τη Μικρονησία
- Ανθρώπινο κορωναϊό OC43 (HCoV-OC43)
- Ο ιός ηπατίτιδας ποντικού (MHV)
- Ο ιός αιμοσυγκολλητικής εγκεφαλομυελίτιδας χοίρου (HEV)
- Κορωναϊός αρουραίου (RCV). Ο αρουραίος των αρουραίων είναι αρκετά διαδεδομένος στην Ανατολική Αυστραλία, όπου, από τον Μάρτιο / Απρίλιο του 2008, έχει βρεθεί μεταξύ των ιθαγενών και άγριων αποικιών τρωκτικών.
- (Δεν υπάρχει κοινή ονομασία ως προς το παρόν) (HCoV-HKU1)
Σοβαρές οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις από κοροναϊό (SARS-CoV)
- Κορωνοϊό του αναπνευστικού συνδρόμου στη Μέση Ανατολή (MERS-CoV)
- Gamma
- Ο ιός της λοιμώδους βρογχίτιδας (IBV)
- Το κορωναϊό της Τουρκίας (ιός ασθένειας Bluecomb)
- Κορνοϊός φασιανός
- Κορωναϊός από φραγκόκοτες
- Δέλτα
- Βολβός κοροναϊού (BuCoV)
- Ο κοροναϊός του θρόμβου (ThCoV)
- Κορωναϊός αυγών (MuCoV)
- Κορωναϊός από χοίρους (PorCov) HKU15
[0045]
Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης του κοροναϊού της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να προέρχεται από αλφαονοϊό όπως το TGEV. ένας ιός βήτα-βορονίου όπως ο MHV. ή ενός ιού γαμακορονόμου όπως IBV.
[0046]
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος «προερχόμενο από» σημαίνει ότι το γονίδιο ρεπλικάσης περιλαμβάνει ουσιαστικά την ίδια αλληλουχία νουκλεοτιδίων όπως το γονίδιο ρεπλικάσης άγριου τύπου του σχετικού κορωναϊού. Για παράδειγμα, το γονίδιο παραλλαγμένης ρεπλικάσης της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να έχει ταυτότητα έως 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ή 99% με την αλληλουχία ρεπλικάσης άγριου τύπου. Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης κοροναϊού κωδικοποιεί πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μετάλλαξη σε μία ή περισσότερες μη δομικής πρωτεΐνης (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 ή nsp-16 σε σύγκριση με την αλληλουχία άγριου τύπου των μη δομικών πρωτεΐνη.
IBV
[0047]
Η λοιμώδης βρογχίτιδα των πτηνών (IB) είναι μια οξεία και εξαιρετικά μεταδοτική αναπνευστική νόσος των κοτόπουλων η οποία προκαλεί σημαντικές οικονομικές απώλειες. Η ασθένεια χαρακτηρίζεται από αναπνευστικά συμπτώματα, που περιλαμβάνουν αναρρόφηση, βήχα, φτάρνισμα, τραχειακή ρήξη και ρινική εκφόρτιση. Στα νεαρά κοτόπουλα μπορεί να εμφανιστεί σοβαρή αναπνευστική δυσχέρεια. Σε στρώματα, η αναπνευστική δυσφορία, η νεφρίτιδα, η μείωση της παραγωγής αυγών και η απώλεια της εσωτερικής ποιότητας των αυγών και η ποιότητα του κελυφωμένου αυγού είναι κοινά.
[0048]
Στα κοτόπουλα, ο βήχας και η κροτάλισμα είναι κοινά κλινικά συμπτώματα, τα οποία διαδίδονται γρήγορα σε όλα τα πτηνά των εγκαταστάσεων. Η νοσηρότητα είναι 100% σε μη εμβολιασμένα σμήνη. Η θνησιμότητα ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία, το στέλεχος του ιού και τις δευτερογενείς λοιμώξεις, αλλά μπορεί να φτάσει έως και 60% σε μη εμβολιασμένα σμήνη.
[0049]
Ο πρώτος οροτύπος IBV που εντοπίστηκε ήταν η Μασαχουσέτη, αλλά στις Ηνωμένες Πολιτείες κυκλοφορούν επί του παρόντος αρκετοί ορότυποι, συμπεριλαμβανομένου του Αρκάνσας και του Ντελάγουερ, πέραν του αρχικά αναγνωρισμένου τύπου Μασσαχουσέττης.
[0050]
Το στέλεχος ΙΒν Beaudette προέκυψε μετά από τουλάχιστον 150 αποχωρήσεις σε έμβρυα κοτόπουλου. Το IBV Beaudette δεν είναι πλέον παθογόνο για τα εκκολαφθέντα κοτόπουλα αλλά ταχέως σκοτώνει τα έμβρυα.
[0051]
Το Η120 είναι ένα εμπορικό ζωντανό εξασθενημένο στέλεχος εμβολίου μολυσματώδους IBV Massachusetts, ελαττωμένο από περίπου 120 περάσματα σε εμβρυϊκά αυγά κοτόπουλου. Το Η52 είναι ένα άλλο εμβόλιο της Μασαχουσέτης και αντιπροσωπεύει έναν παλαιότερο και λίγο περισσότερο παθογόνο ιό διέλευσης (πέρασμα 52) κατά την ανάπτυξη του Η120. Χρησιμοποιούνται συνήθως εμβόλια με βάση το Η120.
[0052]
Το IB QX είναι ένα λοιμογόνο προϊόν απομόνωσης του IBV. Μερικές φορές είναι γνωστή ως "κινεζική QX" καθώς απομονώθηκε αρχικά μετά από εστίες ασθένειας στην περιοχή Qingdao στην Κίνα στα μέσα της δεκαετίας του 1990. Από τότε ο ιός έχει φτάσει στην Ευρώπη. Από το 2004 εντοπίστηκαν σοβαρά προβλήματα παραγωγής αυγών με πολύ παρόμοιο ιό σε μέρη της Δυτικής Ευρώπης, κυρίως στις Κάτω Χώρες, αλλά και από τη Γερμανία, τη Γαλλία, το Βέλγιο, τη Δανία και το Ηνωμένο Βασίλειο.
[0053]
Ο ιός που απομονώθηκε από τις ολλανδικές περιπτώσεις αναγνωρίστηκε από το Ολλανδικό Ινστιτούτο Έρευνας στο Deventer ως ένα νέο στέλεχος που ονόμασαν D388. Η κινεζική σύνδεση προήλθε από περαιτέρω δοκιμές που έδειξαν ότι ο ιός ήταν 99% παρόμοιος με τους κινέζους ιούς QX. Έχει αναπτυχθεί τώρα ένα ζωντανό εξασθενημένο στέλεχος εμβολίου IBV τύπου QX.
[0054]
Το IBV είναι ένας περιτυλιγμένος ιός που αναδιπλασιάζεται στο κυτταρόπλασμα κυττάρων και περιέχει ένα μη τμηματικό, μονόκλωνο γονιδίωμα RNA θετικής λογικής. Το IBV έχει γονιδίωμα RNA 27,6 kb και όπως όλοι οι κοροναϊοί περιέχουν τις τέσσερις δομικές πρωτεΐνες. (S), πρωτεΐνη μικρής μεμβράνης (Ε), ενσωματωμένη πρωτεΐνη μεμβράνης (Μ) και νουκλεοκαψιδική πρωτεΐνη (Ν) η οποία αλληλεπιδρά με το γονιδιωματικό RNA.
[0055]
Το γονιδίωμα οργανώνεται με τον ακόλουθο τρόπο: γονίδιο 5'UTR-πολυμεράσης (ρεπλικάσης) - δομικά γονίδια πρωτεΐνης (SEMN) - UTR 3 '. όπου το UTR είναι αμετάφραστες περιοχές (κάθε ~ 500 νουκλεοτίδια σε ΙΒν).
[0056]
Το λιπιδικό περίβλημα περιέχει τρεις πρωτεΐνες μεμβράνης: S, Μ και Ε. Η πρωτεΐνη IBV S είναι μια γλυκοπρωτεΐνη τύπου Ι η οποία ολιγομερίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και συναρμολογείται σε ομοτριμερές που εισάγεται στη μεμβράνη του ιού μέσω του διαμεμβρανικού τομέα και συνδέεται μέσω μη ομοιοπολικής αλληλεπιδράσεις με την πρωτεΐνη Μ. Μετά την ενσωμάτωση σε σωματίδια κοροναϊού, η πρωτεΐνη S είναι υπεύθυνη για δέσμευση στον υποδοχέα κυττάρου-στόχου και σύντηξη των ιικών και κυτταρικών μεμβρανών. Η γλυκοπρωτεΐνη S αποτελείται από τέσσερις περιοχές: μία αλληλουχία σήματος που διασπάται κατά τη διάρκεια της σύνθεσης. την εκτομή, η οποία είναι παρούσα στο εξωτερικό του σωματιδίου του βιριόντος. η διαμεμβρανική περιοχή που είναι υπεύθυνη για την αγκύρωση της πρωτεΐνης S στη λιπιδική διπλοστοιβάδα του σωματιδίου του βιριόντος. και την κυτταροπλασματική ουρά.
[0057]
Όλοι οι κοροναϊοί κωδικοποιούν επίσης ένα σύνολο βοηθητικών πρωτεϊνών γονιδίων άγνωστης λειτουργίας τα οποία δεν απαιτούνται για την αντιγραφή in vitro, αλλά μπορεί να παίζουν ρόλο στην παθογένεση. Το IBV κωδικοποιεί δύο βοηθητικά γονίδια, τα γονίδια 3 και 5, τα οποία εκφράζουν αμφότερα δύο βοηθητικές πρωτεΐνες 3a, 3b και 5a, 5b, αντίστοιχα.
[0058]
Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης του κοροναϊού της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να προέρχεται από ένα IBV. Για παράδειγμα, το IBV μπορεί να είναι IBV Beaudette, Η120, Η52, ΙΒ QΧ, D388 ή Μ41.
[0059]
Ο IBV μπορεί να είναι IBV M41. Ο M41 είναι ένας πρωτότυπος ορότυπος της Μασαχουσέτης που απομονώθηκε στις ΗΠΑ το 1941. Είναι ένα απομονωμένο προϊόν που χρησιμοποιείται σε πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο ως παθογόνο εργαστηριακό λεκέ και μπορεί να ληφθεί από την ATCC (VR-21 ™). Οι εξασθενημένες παραλλαγές χρησιμοποιούνται επίσης από αρκετούς παραγωγούς εμβολίων ως εμβόλια IBV κατά των οροτύπων της Μασσαχουσέττης που προκαλούν προβλήματα στο πεδίο. Οι παρόντες εφευρέτες επέλεξαν να χρησιμοποιήσουν αυτό το στέλεχος όπως είχαν εργαστεί εδώ και πολλά χρόνια σε αυτόν τον ιό και επειδή είναι διαθέσιμη η αλληλουχία του πλήρους γονιδιώματος του ιού. Το προϊόν απομόνωσης M41, Μ41-ΟΚ, που χρησιμοποιήθηκε από τους παρόντες εφευρέτες, προσαρμόστηκε για να αναπτυχθεί σε κύτταρα πρωτογενών νεφρών νεοσσών (CK) και συνεπώς θεωρήθηκε κατάλληλο για ανάκτηση ως μολυσματικός ιός από cDNA του πλήρους γονιδιώματος.
[0060]
Η αλληλουχία γονιδιώματος του ΙΒν Μ41-ΟΚ παρέχεται ως SEQ Ιϋ ΝΟ: 1.
SEQ Ιϋ ΝΟ: 1 IBV M41-CK Αλληλουχία
ΠΗΓΗ
[0001] [0002] Ο ιός της λοιμώδους βρογχίτιδας των πτηνών (IBV), ο αιτιολογικός παράγοντας της μολυσματικής βρογχίτιδας (ΙΒ), είναι ένα εξαιρετικά μολυσματικό και μεταδοτικό παθογόνο οικόσιτων ορνίθων που αναπαράγεται κυρίως στην αναπνευστική οδό, αλλά και σε επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου, των νεφρών και των ωοθηκών. Το IBV είναι μέλος του Τάγματος Nidovirales , Οικογένεια Coronaviridae, Υποοικογένεια Coronavirinae και Genus Gammacororavirus , γενετικά πολύ παρόμοιοι κοροναϊοί προκαλούν ασθένεια σε γαλοπούλες, φραγκόκοτες και φασιανούς.[0003] Τα κλινικά συμπτώματα της ΙΒ περιλαμβάνουν φτέρνισμα, τραχειακές ουλές, ρινική έκκριση και συριγμό. Τα πτηνά τύπου κρέατος έχουν μειωμένο κέρδος βάρους, ενώ τα πτηνά που ωοτόκουν τα αυγά φέρουν λιγότερα αυγά και παράγουν αυγά χαμηλής ποιότητας. Η λοίμωξη του αναπνευστικού
προσδίδει στα κοτόπουλα δευτερογενείς βακτηριακές λοιμώξεις που μπορεί να είναι θανατηφόρες σε νεοσσούς. Ο ιός μπορεί επίσης να προκαλέσει μόνιμη βλάβη στον ωαγωγό, ειδικά σε νεοσσούς, με αποτέλεσμα τη μείωση της παραγωγής και της ποιότητας των αυγών. και νεφρών, μερικές φορές οδηγώντας σε νεφρική νόσο που μπορεί να είναι θανατηφόρα.[0004] Το IBV έχει αναφερθεί ότι είναι υπεύθυνο για περισσότερες οικονομικές απώλειες στη βιομηχανία πουλερικών από οποιαδήποτε άλλη μολυσματική ασθένεια. Αν και τα ζώντα εξασθενημένα εμβόλια και τα απενεργοποιημένα εμβόλια χρησιμοποιούνται παγκοσμίως στον έλεγχο του IBV, η προστασία που αποκτάται με τη χρήση του εμβολιασμού μπορεί να χαθεί είτε λόγω διακοπής εμβολίου είτε με την εισαγωγή ενός νέου ορότυπου IBV που δεν σχετίζεται με το εμβόλιο που χρησιμοποιήθηκε, κινδύνου για τη βιομηχανία πουλερικών.[0005] Περαιτέρω, υπάρχει ανάγκη στην βιομηχανία να αναπτυχθούν εμβόλια κατάλληλα για χρήση σε ovo, προκειμένου να βελτιωθεί η αποτελεσματικότητα και η αποδοτικότητα των προγραμμάτων εμβολιασμού. Μια μείζων πρόκληση που σχετίζεται με τον εμβολιασμό in ovo είναι ότι ο ιός πρέπει να είναι ικανός να αντιγράφεται παρουσία μητρικών αντισωμάτων έναντι του ιού χωρίς να είναι παθογόνος για το έμβρυο. Τα τρέχοντα εμβόλια IBV προέρχονται από πολλαπλή διέλευση σε εμβρυϊκά αυγά, με αποτέλεσμα ιούς με μειωμένη παθογένεια για τα κοτόπουλα, έτσι ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως ζώντα εξασθενημένα εμβόλια. Ωστόσο, αυτοί οι ιοί σχεδόν πάντα παρουσιάζουν αυξημένη λοιμογόνο δράση στα έμβρυα και συνεπώς δεν μπορούν να χρησιμοποιηθούν για in ovoεμβολιασμό καθώς προκαλούν μειωμένη εκκόλαψη. Σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρείται μείωση κατά 70% της ελαιοκομίας.[0006] Η εξασθένηση μετά από πολλαπλή διέλευση σε εμβρυϊκά αυγά πάσχει επίσης από άλλα μειονεκτήματα. Είναι μια εμπειρική μέθοδος, καθώς η εξασθένηση των ιών είναι τυχαία και θα διαφέρει κάθε φορά που περνάει ο ιός, οπότε η διέλευση του ίδιου ιού μέσω μιας διαφορετικής σειράς αυγών για σκοπούς εξασθένησης θα οδηγήσει σε μια διαφορετική σειρά μεταλλάξεων που οδηγούν σε εξασθένηση. Υπάρχουν επίσης προβλήματα αποτελεσματικότητας που σχετίζονται με τη διαδικασία: μερικές μεταλλάξεις θα επηρεάσουν την αναπαραγωγή του ιού και μερικές από τις μεταλλάξεις μπορεί να κάνουν τον ιό πάρα πολύ εξασθενημένο. Μεταλλάξεις μπορούν επίσης να εμφανιστούν στο γονίδιο S που μπορεί επίσης να επηρεάσει την ανοσογονικότητα έτσι ώστε να επηρεαστεί η επιθυμητή ανοσολογική απόκριση και το πιθανό εμβόλιο να μην προστατεύει από τον απαιτούμενο ορότυπο. Επιπλέον, υπάρχουν προβλήματα που σχετίζονται με την αναστροφή στη λοιμοτοξικότητα και τη σταθερότητα των εμβολίων.[0007] Menachery, VD et αϊ. (2014) J. Virol., Vol. 88, όχι. 8, 4251-4264 ,WO 2005/049814 Α2 καιWO 2004/092360 έχει ήδη αποκαλυφθεί ένας κοροναϊός που περιλαμβάνει μια μετάλλαξη στα nsp-15 και nsp-16 καθώς και μέσα και μεθόδους για τον τρόπο επίτευξης ενός κορωναϊού που περιλαμβάνει τέτοιες μεταλλαγμένες δομικές πρωτεΐνες.[0008] Είναι σημαντικό να αναπτυχθούν νέα και ασφαλέστερα εμβόλια για τον έλεγχο του IBV. Συνεπώς, υπάρχει ανάγκη για εμβόλια IBV που δεν σχετίζονται με αυτά τα θέματα, ιδιαίτερα εμβόλια που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για εμβολιασμό in ovo .[0009] Οι παρόντες εφευρέτες έχουν χρησιμοποιήσει μια προσέγγιση αντίστροφης γενετικής προκειμένου να εξασθενίσουν ορθολογικά το IBV. Αυτή η προσέγγιση είναι πολύ πιο ελεγχόμενη από την τυχαία εξασθένηση μετά από πολλαπλές διελεύσεις σε εμβρυϊκά αυγά επειδή η θέση κάθε μετάλλαξης είναι γνωστή και μπορεί να προκύψει η επίδρασή της στον ιό, δηλαδή ο λόγος της εξασθένησης.[0010] Χρησιμοποιώντας την αντίστροφη γενετική προσέγγισή τους, οι παρόντες εφευρέτες έχουν εντοπίσει διάφορες μεταλλάξεις που προκαλούν τον ιό να έχει μειωμένα επίπεδα παθογονικότητας. Τα επίπεδα της παθογονικότητας μπορούν να μειωθούν έτσι ώστε όταν ο ιός χορηγείται σε ένα εμβρυϊκό αυγό, είναι ικανό να αναδιπλασιαστεί χωρίς να είναι παθογόνο στο έμβρυο. Αυτοί οι ιοί μπορεί να είναι κατάλληλοι για εμβολιασμό in ovo , ο οποίος είναι ένα σημαντικό πλεονέκτημα και έχει βελτίωση έναντι των εξασθενημένων εμβολίων IBV που παράγονται μετά από πολλαπλή διέλευση σε εμβρυϊκά αυγά.[0011] Έτσι, σε μια πρώτη άποψη, η παρούσα εφεύρεση παρέχει ένα ζωντανό εξασθενημένο κοροναϊό που περιλαμβάνει ένα παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης που κωδικοποιεί πολυπρωτεΐνες που περιλαμβάνουν μια μετάλλαξη στο nsp-14, όπου το γονίδιο παραλλαγμένης ρεπλικάσης κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μετάλλαξη αμινοξέος Val σε Leu στη θέση που αντιστοιχεί στη θέση 393 της SEQ ID ΝΟ: 7.[0012] Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί περαιτέρω να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μία ή περισσότερες μεταλλάξεις αμινοξέων που επιλέγονται από τον κατάλογο:- Pro προς Leu στη θέση 85 της SEQ ID ΝΟ: 6,
- Leu να βρίσκεται στη θέση 183 της αλληλουχίας αρ. 8,
- Val να βρίσκεται στη θέση 209 της αλληλουχίας αρ. 9.
[0013] Το γονίδιο της ρεπλικάσης μπορεί περαιτέρω να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει την μετάλλαξη αμινοξέων Pro σε Leu στη θέση 85 της αλληλουχίας αρ. 6.[0014] Το γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει τις μεταλλάξεις αμινοξέων Val προς Leu στη θέση 393 της αλληλουχίας αρ. 7, το Leu να βρίσκεται στη θέση 183 της αλληλουχίας αρ. 8, και Val να βρίσκεται στη θέση 209 της αλληλουχίας αρ. 9.[0015] Το γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί να κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει τις μεταλλάξεις αμινοξέων Pro προς Leu στη θέση 85 της αλληλουχίας αρ. 6, Val προς Leu στη θέση 393 της SEQ ID ΝΟ: 7, Leu να βρίσκεται στη θέση 183 της αλληλουχίας αρ. 8, και Val να βρίσκεται στη θέση 209 της αλληλουχίας αρ. 9.[0016] Το γονίδιο ρεπλικάσης μπορεί να περιλαμβάνει μία ή περισσότερες υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων που επιλέγονται από τον κατάλογο:- C έως Τ στη νουκλεοτιδική θέση 12137,
- G έως C σε θέση νουκλεοτιδίου 18114,
- Τ προς Α στη θέση νουκλεοτιδίου 19047, και
- G προς Α σε νουκλεοτιδική θέση 20139,
- σε σύγκριση με την αλληλουχία που δείχνεται ως αλληλουχία αρ. 1.
[0017] Ο κορωναϊός μπορεί να είναι ένας ιός μολυσματικής βρογχίτιδας (IBV).[0018] Ο κορωναϊός μπορεί να είναι ΙΒν Μ41.[0019] Ο κορωναϊός μπορεί να περιλαμβάνει μια πρωτεΐνη S τουλάχιστον ένα μέρος της οποίας προέρχεται από έναν ορότυπο IBV διαφορετικό από τον Μ41.[0020] Για παράδειγμα, η υπομονάδα S1 ή ολόκληρη η πρωτεΐνη S μπορεί να είναι από έναν ορότυπο IBV διαφορετικό από τον Μ41.[0021] Ο κορωναϊός σύμφωνα με την πρώτη άποψη έχει μειώσει την παθογονικότητα σε σύγκριση με έναν κοροναϊό που εκφράζει μια αντίστοιχη αγρίου τύπου ρεπλικάση, έτσι ώστε όταν ο ιός χορηγείται σε ένα εμβρυοποιημένο ωάριο, είναι ικανό να αναδιπλασιαστεί χωρίς να είναι παθογόνο στο έμβρυο.[0022] Σε μια δεύτερη άποψη, παρέχεται ένα παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης όπως ορίζεται στις αξιώσεις.[0023] Σε μια τρίτη άποψη, παρέχεται μία πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από ένα γονίδιο ρεπλικάσης παραλλαγμένου κορονάριου όπως ορίζεται στις αξιώσεις.[0024] Σε μια τέταρτη άποψη, παρέχεται ένα πλασμίδιο που περιλαμβάνει ένα γονίδιο ρεπλικάσης όπως ορίζεται στις αξιώσεις.[0025] Σε μια πέμπτη άποψη, παρέχεται μια μέθοδος για την κατασκευή του κοροναϊού όπως ορίζεται στις αξιώσεις η οποία περιλαμβάνει τα ακόλουθα στάδια:
- (ί) διαμόλυνση ενός πλασμιδίου σύμφωνα με την τέταρτη άποψη της εφεύρεσης σε ένα κύτταρο ξενιστή,
- (ϋ) μόλυνση του κυττάρου ξενιστή με έναν ανασυνδυασμένο ιό που περιλαμβάνει το γονιδίωμα ενός στελέχους κορωνοϊού με ένα γονίδιο ρεπλικάσης,
- (ίϋ) επιτρέποντας την εμφάνιση ομόλογου ανασυνδυασμού μεταξύ των αλληλουχιών γονιδίου ρεπλικάσης στο πλασμίδιο και των αντίστοιχων αλληλουχιών στο γονιδίωμα ανασυνδυασμού του ιού για παραγωγή ενός τροποποιημένου γονιδίου ρεπλικάσης, και
- (ίν) επιλογή για ανασυνδυασμό ιού που περιλαμβάνει το τροποποιημένο γονίδιο ρεπλικάσης.
Ο ανασυνδυασμένος ιός μπορεί να είναι ένας ιός δαμαλίτιδας.
Η μέθοδος μπορεί επίσης να περιλαμβάνει το στάδιο:
(ν) ανάκτηση ανασυνδυασμένου κοροναϊού που περιλαμβάνει το τροποποιημένο γονίδιο ρεπλικάσης από το DNA από τον ανασυνδυασμένο ιό από το στάδιο (ίν).
(ν) ανάκτηση ανασυνδυασμένου κοροναϊού που περιλαμβάνει το τροποποιημένο γονίδιο ρεπλικάσης από το DNA από τον ανασυνδυασμένο ιό από το στάδιο (ίν).
Ένα κύτταρο ικανό να παράγει κοροναϊό σύμφωνα με την πρώτη άποψη παρέχεται.
Σε μία άλλη άποψη, παρέχεται ένα εμβόλιο που περιλαμβάνει κορωναϊό όπως ορίζεται στις αξιώσεις και φαρμακευτικώς αποδεκτό φορέα.
Επίσης περιγράφεται εδώ μια μέθοδος θεραπείας και / ή πρόληψης ασθένειας σε ένα υποκείμενο που περιλαμβάνει το στάδιο της χορήγησης ενός εμβολίου σύμφωνα με την εφεύρεση στο άτομο.
Περαιτέρω απόψεις της εφεύρεσης παρέχουν:
- το εμβόλιο όπως ορίζεται στις αξιώσεις για χρήση στην πρόληψη ασθένειας σε ένα υποκείμενο.
Επίσης περιγράφεται εδώ η χρήση ενός κοροναϊού σύμφωνα με την πρώτη άποψη στην παρασκευή ενός εμβολίου για τη θεραπεία και / ή την πρόληψη μιας ασθένειας σε ένα υποκείμενο.
Η ασθένεια μπορεί να είναι μολυσματική βρογχίτιδα (IB).
Η μέθοδος χορήγησης του εμβολίου μπορεί να επιλέγεται από την ομάδα που αποτελείται από: χορήγηση οφθαλμικών σταγόνων, ενδορινική χορήγηση, χορήγηση πόσιμου ύδατος, ένεση μετά την εκκόλαψη και ένεση in ovo .
Ο εμβολιασμός μπορεί να γίνεται με εμβολιασμό in ovo .
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει επίσης μια μέθοδο για την παραγωγή ενός εμβολίου όπως ορίζεται στις αξιώσεις που περιλαμβάνει το στάδιο μολύνσεως ενός κυττάρου όπως ορίζεται στις αξιώσεις με έναν κοροναϊό όπως ορίζεται στις αξιώσεις.
Φιγούρα 1 - Κινητική ανάπτυξη των M41-R-6 και M41-R-12 σε σύγκριση με το M41-CK (M41 ΕΡ4) σε κύτταρα CKΣχήμα 2 - Κλινικά σημάδια, χτύπημα και συριγμός, που σχετίζονται με τα Μ41-R-6 και M41-R-12 σε σύγκριση με τα M41-CK (M41 EP4) και Beau-R (Μπάρα παρουσιάζουν ψευδαισθήσεις Beau-R, M41-R6, R 12, M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 3 - Ακτινωτή δραστηριότητα των ιών στους τραχειακούς δακτυλίους που απομονώνονται από τραχεία που λαμβάνονται από μολυσμένες νεοσσοί. Η ακτινοβολία 100% δεικνύει καμία επίδραση από τον ιό. (Bars show fake, Beau-R, M41-R6, M41-R12, M41-CK ΕΡ4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου ).Σχήμα 4 - Κλινικά συμπτώματα, αιμορραγία, που σχετίζονται με τα M41R-nsp10rep και M41R-nsp14,15,16rep σε σύγκριση με τα M41-R-12 και M41-CK (Μ41 ΕΡ5) (Οι ράβδοι δείχνουν ψεύτικες, M41-R12, M41R-nsp10rep, M41R -nsp14,15,16rep και M41-CK EP5 από τα αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 5 - Η ακτινωτή δραστηριότητα των M41R-nsp10rep και M41R-nsp14,15,16rep σε σύγκριση με τα Μ41-R-12 και M41-CK σε τραχειακούς δακτυλίους που απομονώθηκαν από τραχεία που ελήφθησαν από μολυσμένες νεοσσοί (Μάρκες παρουσιάζουν ψεύτικα, M41-R12, M41R-nsp10rep, M41R -nsp14,15,16rep και M41-CK EP5 από τα αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 6 - Κλινικά συμπτώματα που σχετίζονται με τα M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10,15,16rep και M41-K σε σύγκριση με το M41-CK M41R-nsp10,15rep1 · M41R-nsp10,14,16rep4 · M41R-nsp10,15,16rep8 · M41R-nsp10,14,15rep10 · M41-K6 και M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά για κάθε χρονικό σημείο).Σχήμα 7 - Κλινικά συμπτώματα, συριγμό, που συνδέονται με τα M41R-nsp10, 15rep, M41R-nsp10, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp1 0, 15, 16rep και M41-K σε σύγκριση με M41-CK δείχνουν ψεύτικα, M41R-nsp10,15rep1 · M41R-nsp10,14,16rep4 · M41R-nsp10,15,16rep8 · M41R-nsp10,14,15rep10 · M41-K6 και M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 8 - Η ακτινωτή δραστηριότητα των M41R-nsp1 0, 15rep, M41R-nsp1 0, 14, 15rep, M41R-nsp10, 14, 16rep, M41R-nsp10, 15, 16rep και M41-K σε σύγκριση με το M41-CK σε τραχειακούς δακτυλίους απομονωμένους από τραχεία που ελήφθησαν από μολυνθέντες νεοσσούς (οι ράβδοι δείχνουν ψεύτικα, M41R-nsp10,15rep1 · M41R-nsp10,14,16rep4 · M41R-nsp10,15,16rep8 · M41R-nsp10,14,15rep10 · M41-K6 και M41-CK EP4 από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).Σχήμα 9 - Κινητική ανάπτυξη των rIBVs σε σύγκριση με το M41-CK σε κύτταρα CK.Σχήμα 9Α δείχνει τα αποτελέσματα για τα M41-R και M41-K.Σχ. 9Β δείχνει τα αποτελέσματα για τον M41-nsp10 rep. M41 R-nsp14, 15, 16 rep; M41 R-nsp1 0, 15 rep. M41 R-nsp10, 15, 16 rep; M41R-nsp10, 14, 15 rep. και M41R-nsp10, 14, 16.Σχήμα 10 - Θέση μεταλλάξεων αμινοξέων σε μεταλλαγμένες αλληλουχίες nsp10, nsp14, nsp15 και nsp16.Σχήμα 11 - Α) Χτύπημα. Β) Συμπτώματα του αναπνευστικού συστήματος (συριγμός και συσπάσματα συνδυασμένα) και C) Ακτινωτή δραστηριότητα του rIBV M41R-nsp10,14 rep και rIBV M41R-nsp10,16 rep σε σύγκριση με το Μ41-CK (Οι ράβδοι δείχνουν εικονικές, M41R-nsp10,14rep · M41R-nsp10 , 16rep και M41-K από αριστερά προς τα δεξιά κάθε χρονικού σημείου).
Η παρούσα εφεύρεση παρέχει έναν κορωναϊό που περιλαμβάνει ένα γονίδιο παραλλαγής ρεπλικάσης το οποίο, όταν εκφράζεται στον κορωναϊό, προκαλεί τον ιό να έχει μειωμένη παθογονικότητα σε σύγκριση με έναν αντίστοιχο κοροναϊό ο οποίος περιλαμβάνει το γονίδιο ρεπλικάσης άγριου τύπου.
Ο ιός Gammacoron είναι ένα γένος του ζωικού ιού που ανήκει στην οικογένεια Coronaviridae. Οι κορωναϊοί είναι επικαλυμμένοι ιοί με γονιδίωμα RNA μονού κλώνου θετικής λογικής και ελικοειδής συμμετρία.
Το γονιδιωματικό μέγεθος των κοροναϊών κυμαίνεται από περίπου 27 έως 32 kilobases, το οποίο είναι το μακρύτερο μέγεθος για οποιοδήποτε γνωστό ιό RNA.
Οι κορωναϊοί μολύνουν κυρίως την ανώτερη αναπνευστική ή γαστρεντερική οδό θηλαστικών και πτηνών. Πέντε έως έξι διαφορετικά επί του παρόντος γνωστά στελέχη κοροναϊών μολύνουν ανθρώπους. Ο πιο δημοφιλής ανθρώπινος κοροναϊός, το SARS-CoV που προκαλεί σοβαρό οξύ αναπνευστικό σύνδρομο (SARS), έχει μια μοναδική παθογένεια επειδή προκαλεί και λοιμώξεις του ανώτερου και του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος και μπορεί επίσης να προκαλέσει γαστρεντερίτιδα. Το κορωναϊό του αναπνευστικού συνδρόμου στη Μέση Ανατολή (MERS-CoV) προκαλεί επίσης μια λοίμωξη του κατώτερου αναπνευστικού συστήματος στον άνθρωπο. Οι κοροναϊοί πιστεύεται ότι προκαλούν σημαντικό ποσοστό όλων των συνήθων κρυολογήσεων σε ανθρώπους ενήλικες.
Οι κοροναϊοί προκαλούν επίσης μια σειρά ασθενειών σε ζώα και κατοικίδια κατοικίδια ζώα, μερικά από τα οποία μπορεί να είναι σοβαρά και αποτελούν απειλή για τη γεωργική βιομηχανία. Οι οικονομικά σημαντικοί κοροναϊοί των ζώων κτηνοτροφίας περιλαμβάνουν τον ιό της μολυσματικής βρογχίτιδας (IBV), ο οποίος προκαλεί κυρίως αναπνευστική νόσο στα κοτόπουλα και επηρεάζει σοβαρά τη βιομηχανία πουλερικών παγκοσμίως. κοροναϊό χοίρου (μεταδοτική γαστρεντερίτιδα, TGE) και κορωναϊού βοοειδών, τα οποία οδηγούν σε διάρροια σε νεαρά ζώα. Ο κορωναϊός από γάτα έχει δύο μορφές, ο εντερικός κοροναϊός αιλουροειδών είναι ένας παθογόνος παράγοντας με μικρή κλινική σημασία, αλλά η αυθόρμητη μετάλλαξη αυτού του ιού μπορεί να οδηγήσει σε λοιμώδη περιτονίτιδα της γάτας (FIP), μια ασθένεια που σχετίζεται με υψηλή θνησιμότητα.
Υπάρχουν επίσης δύο τύποι κορώνων ιού σκύλου (CCoV), ένας που προκαλεί ήπια γαστρεντερική νόσο και ένας που έχει βρεθεί ότι προκαλεί αναπνευστική νόσο. Ο ιός της ηπατίτιδας του ποντικιού (MHV) είναι ένας κορωναϊός που προκαλεί επιδημική ασθένεια ποντικού με υψηλή θνησιμότητα, ειδικά μεταξύ αποικιών εργαστηριακών ποντικών.
Οι κορωναϊοί χωρίζονται σε τέσσερις ομάδες, όπως φαίνεται παρακάτω:
- Αλφα
- Ο κορωναϊός του σκύλου (CCoV)
- Κορωναϊός από γάτα (FeCoV)
- Ο ανθρώπινος κοροναϊός 229Ε (HCoV-229Ε)
- Ο ιός της διάρροιας των επιδημικών χοίρων (PEDV)
- Ο μεταδοτικός ιός της γαστρεντερίτιδας (TGEV)
- Ανθρώπινο κορωναϊό NL63 (NL ή New Haven)
- Βήτα
- Ο κοροναϊός των βοοειδών (BCoV)
- Κορνοϊός του αναπνευστικού σκύλου (CRCoV) - Κοινός στη ΝΑ Ασία και τη Μικρονησία
- Ανθρώπινο κορωναϊό OC43 (HCoV-OC43)
- Ο ιός ηπατίτιδας ποντικού (MHV)
- Ο ιός αιμοσυγκολλητικής εγκεφαλομυελίτιδας χοίρου (HEV)
- Κορωναϊός αρουραίου (RCV). Ο αρουραίος των αρουραίων είναι αρκετά διαδεδομένος στην Ανατολική Αυστραλία, όπου, από τον Μάρτιο / Απρίλιο του 2008, έχει βρεθεί μεταξύ των ιθαγενών και άγριων αποικιών τρωκτικών.
- (Δεν υπάρχει κοινή ονομασία ως προς το παρόν) (HCoV-HKU1)
Σοβαρές οξείες αναπνευστικές λοιμώξεις από κοροναϊό (SARS-CoV) - Κορωνοϊό του αναπνευστικού συνδρόμου στη Μέση Ανατολή (MERS-CoV)
- Gamma
- Ο ιός της λοιμώδους βρογχίτιδας (IBV)
- Το κορωναϊό της Τουρκίας (ιός ασθένειας Bluecomb)
- Κορνοϊός φασιανός
- Κορωναϊός από φραγκόκοτες
- Δέλτα
- Βολβός κοροναϊού (BuCoV)
- Ο κοροναϊός του θρόμβου (ThCoV)
- Κορωναϊός αυγών (MuCoV)
- Κορωναϊός από χοίρους (PorCov) HKU15
Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης του κοροναϊού της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να προέρχεται από αλφαονοϊό όπως το TGEV. ένας ιός βήτα-βορονίου όπως ο MHV. ή ενός ιού γαμακορονόμου όπως IBV.
Όπως χρησιμοποιείται στο παρόν, ο όρος «προερχόμενο από» σημαίνει ότι το γονίδιο ρεπλικάσης περιλαμβάνει ουσιαστικά την ίδια αλληλουχία νουκλεοτιδίων όπως το γονίδιο ρεπλικάσης άγριου τύπου του σχετικού κορωναϊού. Για παράδειγμα, το γονίδιο παραλλαγμένης ρεπλικάσης της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να έχει ταυτότητα έως 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ή 99% με την αλληλουχία ρεπλικάσης άγριου τύπου. Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης κοροναϊού κωδικοποιεί πρωτεΐνη που περιλαμβάνει μετάλλαξη σε μία ή περισσότερες μη δομικής πρωτεΐνης (nsp) -10, nsp-14, nsp-15 ή nsp-16 σε σύγκριση με την αλληλουχία άγριου τύπου των μη δομικών πρωτεΐνη.
Η λοιμώδης βρογχίτιδα των πτηνών (IB) είναι μια οξεία και εξαιρετικά μεταδοτική αναπνευστική νόσος των κοτόπουλων η οποία προκαλεί σημαντικές οικονομικές απώλειες. Η ασθένεια χαρακτηρίζεται από αναπνευστικά συμπτώματα, που περιλαμβάνουν αναρρόφηση, βήχα, φτάρνισμα, τραχειακή ρήξη και ρινική εκφόρτιση. Στα νεαρά κοτόπουλα μπορεί να εμφανιστεί σοβαρή αναπνευστική δυσχέρεια. Σε στρώματα, η αναπνευστική δυσφορία, η νεφρίτιδα, η μείωση της παραγωγής αυγών και η απώλεια της εσωτερικής ποιότητας των αυγών και η ποιότητα του κελυφωμένου αυγού είναι κοινά.
Στα κοτόπουλα, ο βήχας και η κροτάλισμα είναι κοινά κλινικά συμπτώματα, τα οποία διαδίδονται γρήγορα σε όλα τα πτηνά των εγκαταστάσεων. Η νοσηρότητα είναι 100% σε μη εμβολιασμένα σμήνη. Η θνησιμότητα ποικίλλει ανάλογα με την ηλικία, το στέλεχος του ιού και τις δευτερογενείς λοιμώξεις, αλλά μπορεί να φτάσει έως και 60% σε μη εμβολιασμένα σμήνη.
Ο πρώτος οροτύπος IBV που εντοπίστηκε ήταν η Μασαχουσέτη, αλλά στις Ηνωμένες Πολιτείες κυκλοφορούν επί του παρόντος αρκετοί ορότυποι, συμπεριλαμβανομένου του Αρκάνσας και του Ντελάγουερ, πέραν του αρχικά αναγνωρισμένου τύπου Μασσαχουσέττης.
Το στέλεχος ΙΒν Beaudette προέκυψε μετά από τουλάχιστον 150 αποχωρήσεις σε έμβρυα κοτόπουλου. Το IBV Beaudette δεν είναι πλέον παθογόνο για τα εκκολαφθέντα κοτόπουλα αλλά ταχέως σκοτώνει τα έμβρυα.
Το Η120 είναι ένα εμπορικό ζωντανό εξασθενημένο στέλεχος εμβολίου μολυσματώδους IBV Massachusetts, ελαττωμένο από περίπου 120 περάσματα σε εμβρυϊκά αυγά κοτόπουλου. Το Η52 είναι ένα άλλο εμβόλιο της Μασαχουσέτης και αντιπροσωπεύει έναν παλαιότερο και λίγο περισσότερο παθογόνο ιό διέλευσης (πέρασμα 52) κατά την ανάπτυξη του Η120. Χρησιμοποιούνται συνήθως εμβόλια με βάση το Η120.
Το IB QX είναι ένα λοιμογόνο προϊόν απομόνωσης του IBV. Μερικές φορές είναι γνωστή ως "κινεζική QX" καθώς απομονώθηκε αρχικά μετά από εστίες ασθένειας στην περιοχή Qingdao στην Κίνα στα μέσα της δεκαετίας του 1990. Από τότε ο ιός έχει φτάσει στην Ευρώπη. Από το 2004 εντοπίστηκαν σοβαρά προβλήματα παραγωγής αυγών με πολύ παρόμοιο ιό σε μέρη της Δυτικής Ευρώπης, κυρίως στις Κάτω Χώρες, αλλά και από τη Γερμανία, τη Γαλλία, το Βέλγιο, τη Δανία και το Ηνωμένο Βασίλειο.
Ο ιός που απομονώθηκε από τις ολλανδικές περιπτώσεις αναγνωρίστηκε από το Ολλανδικό Ινστιτούτο Έρευνας στο Deventer ως ένα νέο στέλεχος που ονόμασαν D388. Η κινεζική σύνδεση προήλθε από περαιτέρω δοκιμές που έδειξαν ότι ο ιός ήταν 99% παρόμοιος με τους κινέζους ιούς QX. Έχει αναπτυχθεί τώρα ένα ζωντανό εξασθενημένο στέλεχος εμβολίου IBV τύπου QX.
Το IBV είναι ένας περιτυλιγμένος ιός που αναδιπλασιάζεται στο κυτταρόπλασμα κυττάρων και περιέχει ένα μη τμηματικό, μονόκλωνο γονιδίωμα RNA θετικής λογικής. Το IBV έχει γονιδίωμα RNA 27,6 kb και όπως όλοι οι κοροναϊοί περιέχουν τις τέσσερις δομικές πρωτεΐνες. (S), πρωτεΐνη μικρής μεμβράνης (Ε), ενσωματωμένη πρωτεΐνη μεμβράνης (Μ) και νουκλεοκαψιδική πρωτεΐνη (Ν) η οποία αλληλεπιδρά με το γονιδιωματικό RNA.
Το γονιδίωμα οργανώνεται με τον ακόλουθο τρόπο: γονίδιο 5'UTR-πολυμεράσης (ρεπλικάσης) - δομικά γονίδια πρωτεΐνης (SEMN) - UTR 3 '. όπου το UTR είναι αμετάφραστες περιοχές (κάθε ~ 500 νουκλεοτίδια σε ΙΒν).
Το λιπιδικό περίβλημα περιέχει τρεις πρωτεΐνες μεμβράνης: S, Μ και Ε. Η πρωτεΐνη IBV S είναι μια γλυκοπρωτεΐνη τύπου Ι η οποία ολιγομερίζεται στο ενδοπλασματικό δίκτυο και συναρμολογείται σε ομοτριμερές που εισάγεται στη μεμβράνη του ιού μέσω του διαμεμβρανικού τομέα και συνδέεται μέσω μη ομοιοπολικής αλληλεπιδράσεις με την πρωτεΐνη Μ. Μετά την ενσωμάτωση σε σωματίδια κοροναϊού, η πρωτεΐνη S είναι υπεύθυνη για δέσμευση στον υποδοχέα κυττάρου-στόχου και σύντηξη των ιικών και κυτταρικών μεμβρανών. Η γλυκοπρωτεΐνη S αποτελείται από τέσσερις περιοχές: μία αλληλουχία σήματος που διασπάται κατά τη διάρκεια της σύνθεσης. την εκτομή, η οποία είναι παρούσα στο εξωτερικό του σωματιδίου του βιριόντος. η διαμεμβρανική περιοχή που είναι υπεύθυνη για την αγκύρωση της πρωτεΐνης S στη λιπιδική διπλοστοιβάδα του σωματιδίου του βιριόντος. και την κυτταροπλασματική ουρά.
Όλοι οι κοροναϊοί κωδικοποιούν επίσης ένα σύνολο βοηθητικών πρωτεϊνών γονιδίων άγνωστης λειτουργίας τα οποία δεν απαιτούνται για την αντιγραφή in vitro, αλλά μπορεί να παίζουν ρόλο στην παθογένεση. Το IBV κωδικοποιεί δύο βοηθητικά γονίδια, τα γονίδια 3 και 5, τα οποία εκφράζουν αμφότερα δύο βοηθητικές πρωτεΐνες 3a, 3b και 5a, 5b, αντίστοιχα.
Το παραλλαγμένο γονίδιο ρεπλικάσης του κοροναϊού της παρούσας εφεύρεσης μπορεί να προέρχεται από ένα IBV. Για παράδειγμα, το IBV μπορεί να είναι IBV Beaudette, Η120, Η52, ΙΒ QΧ, D388 ή Μ41.
Ο IBV μπορεί να είναι IBV M41. Ο M41 είναι ένας πρωτότυπος ορότυπος της Μασαχουσέτης που απομονώθηκε στις ΗΠΑ το 1941. Είναι ένα απομονωμένο προϊόν που χρησιμοποιείται σε πολλά εργαστήρια σε όλο τον κόσμο ως παθογόνο εργαστηριακό λεκέ και μπορεί να ληφθεί από την ATCC (VR-21 ™). Οι εξασθενημένες παραλλαγές χρησιμοποιούνται επίσης από αρκετούς παραγωγούς εμβολίων ως εμβόλια IBV κατά των οροτύπων της Μασσαχουσέττης που προκαλούν προβλήματα στο πεδίο. Οι παρόντες εφευρέτες επέλεξαν να χρησιμοποιήσουν αυτό το στέλεχος όπως είχαν εργαστεί εδώ και πολλά χρόνια σε αυτόν τον ιό και επειδή είναι διαθέσιμη η αλληλουχία του πλήρους γονιδιώματος του ιού. Το προϊόν απομόνωσης M41, Μ41-ΟΚ, που χρησιμοποιήθηκε από τους παρόντες εφευρέτες, προσαρμόστηκε για να αναπτυχθεί σε κύτταρα πρωτογενών νεφρών νεοσσών (CK) και συνεπώς θεωρήθηκε κατάλληλο για ανάκτηση ως μολυσματικός ιός από cDNA του πλήρους γονιδιώματος.
Η αλληλουχία γονιδιώματος του ΙΒν Μ41-ΟΚ παρέχεται ως SEQ Ιϋ ΝΟ: 1.
SEQ Ιϋ ΝΟ: 1 IBV M41-CK Αλληλουχία
SEQ Ιϋ ΝΟ: 1 IBV M41-CK Αλληλουχία
Δεν υπάρχουν σχόλια:
Δημοσίευση σχολίου